近年二代基因測序（next-generationsequencing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應用已進(jìn)展至臨床檢測，如遺傳疾病、實(shí)體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類(lèi)白細胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。國內外有關(guān)學(xué)會(huì )已出臺相關(guān)共識與指南以推動(dòng)其在臨床中的應用。中華醫學(xué)會(huì )病理學(xué)分會(huì )和中國抗癌協(xié)會(huì )腫瘤病理專(zhuān)委會(huì )前期組織病理、臨床、生物信息等專(zhuān)家進(jìn)行了充分討論，擬在NGS的操作流程、數據處理、結果解讀等方面作規范和建議，以規范NGS在分子病理領(lǐng)域的應用。
臨床分子病理實(shí)驗室NGS樣本可采用甲醛固定石蠟包埋組織（formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE）、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊、石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。本共識特色是基于病理評估的組織樣本（FFPE、新鮮）的規范。測序分析范圍基于目前臨床需求，本共識著(zhù)重在于目標區域測序（panel）分析的實(shí)踐。隨著(zhù)技術(shù)的更新和應用的成熟，本共識將持續更新以滿(mǎn)足臨床需求。
一、實(shí)驗室總體要求
NGS檢測實(shí)驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實(shí)驗室建設指南（試行）》、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作導則》、《個(gè)體化醫學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》、《腫瘤個(gè)體化治療檢測技術(shù)指南》、《個(gè)體化醫學(xué)檢測實(shí)驗室管理辦法》、《測序技術(shù)的個(gè)體化醫學(xué)檢測應用技術(shù)指南（試行）》進(jìn)行。
1.NGS檢測人員的資質(zhì)要求：NGS檢測技術(shù)人員應具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專(zhuān)業(yè)大專(zhuān)以上學(xué)歷，并經(jīng)過(guò)NGS技術(shù)的理論與技能培訓合格。數據分析人員應具有臨床醫學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓合格的本單位執業(yè)醫師或者授權簽字人（醫學(xué)博士學(xué)位或高級職稱(chēng)）審核。
2.NGS檢測實(shí)驗室的區域設置要求：原則上NGS實(shí)驗室應當有以下分區：樣本前處理區、試劑儲存和準備區、樣本制備區、文庫制備區、雜交捕獲區/多重PCR區域（第一擴增區）、文庫擴增區（第二擴增區）、文庫檢測與質(zhì)控區、測序區、數據存貯區。各工作區空氣及人員流向需要嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作導則》。分區可根據實(shí)際情況合并，但是在前處理和建庫時(shí)，血液樣本應與組織樣本分開(kāi)。
3.NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監督管理總局（CFDA）認可產(chǎn)品。涉及到實(shí)驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規程（SOP），需經(jīng)過(guò)臨床實(shí)驗室自建項目（LDT）驗證合格才可使用。每個(gè)NGS檢測項目在驗證時(shí)需要根據建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類(lèi)型包括，單堿基突變singlenucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數變異Copynumbervariations（CNVs）、染色體結構變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類(lèi)型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的準確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數進(jìn)行LDT驗證。應該有經(jīng)過(guò)標準品測試的在不同的mutantallelefrequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數據，確定不同樣本的可信的測序深度。經(jīng)驗證后，SOP發(fā)生的任何改動(dòng)，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實(shí)驗結果簽名留底備案。
4.NGS檢測實(shí)驗室的質(zhì)量管理要求：NGS檢測主要包括實(shí)驗操作和生物信息學(xué)分析兩部分。實(shí)驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標區域富集、測序等；生物信息學(xué)分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實(shí)驗室質(zhì)量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評以有及持續的質(zhì)量保證和改進(jìn)計劃。
二、NGS分析樣本、基因panel和轉運要求
NGS分析樣本類(lèi)型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。
對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應首選經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數據基礎上的再次檢測可選取液體樣本動(dòng)態(tài)監測。
NGS檢測前需通過(guò)病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據不同腫瘤類(lèi)型選擇合適的基因panel測序。
不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機構的專(zhuān)家共同決定，已達到不同實(shí)驗室之間的可比性和完善性。
未經(jīng)病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
樣本質(zhì)量對檢測結果和分析至關(guān)重要，病理醫師需要對可評估的樣本進(jìn)一步明確病理診斷，并評價(jià)標本有無(wú)出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCl脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上，低于此標準可富集后檢測。
NGS檢測實(shí)驗室應對不同類(lèi)型的樣本有采集及處理SOP指導。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實(shí)驗室應有不同的樣本運送SOP，物流環(huán)節（含冷鏈運輸）應有相關(guān)運送記錄，確保樣本運送安全、無(wú)污染、無(wú)降解。
三、NGS檢測流程中的質(zhì)量標準
1.核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是NGS檢測成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質(zhì)量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據不同的樣本類(lèi)型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。
2.文庫制備及其質(zhì)量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無(wú)論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建立實(shí)驗室檢測SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進(jìn)行質(zhì)量分析。每個(gè)檢測項目應設定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標準。
3.NGS測序儀上機分析及其質(zhì)量分析：NGS建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時(shí)根據檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當的芯片，以保證測序質(zhì)量和靶區覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進(jìn)行測序。產(chǎn)生的測序數據質(zhì)量參數要求詳見(jiàn)后文。
4.NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過(guò)程中樣本沒(méi)有混淆或污染，可選用多個(gè)SNV位點(diǎn)或其他標簽作為樣本身份標識（sampleID），在檢測前對每個(gè)樣本進(jìn)行SNV位點(diǎn)信息的測定，在NGS檢測后對上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒(méi)有交叉污染。（2）陽(yáng)性對照：應用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實(shí)驗時(shí)同時(shí)檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無(wú)核酸或明確無(wú)突變的樣本作為模板同時(shí)進(jìn)行檢測，以確保檢測過(guò)程中沒(méi)有污染或非特異性。（4）應對方案和替代方法：各個(gè)質(zhì)量控制步驟中如出現異?；蚴?，實(shí)驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質(zhì)量差或有問(wèn)題的區域應建立替代方法（如Sanger測序）。
四、生物信息分析
NGS數據的生物信息分析可分為兩個(gè)主要步驟：一是對測序數據進(jìn)行質(zhì)控分析及過(guò)濾。二是對通過(guò)質(zhì)控的序列進(jìn)行變異位點(diǎn)鑒定分析并注釋。所用各種生物信息分析軟件，都要通過(guò)適量標準品測序數據進(jìn)行驗證，證明所用軟件及參數可達到臨床報告的要求。
1.NGS生物信息分析流程標準：（1）質(zhì)控分析：為保證分析結果的可靠性，需要對原始的測序數據進(jìn)行質(zhì)量控制與過(guò)濾。測序數據的質(zhì)量控制主要包含4個(gè)方面：質(zhì)量評估、去接頭序列、去低質(zhì)量序列、去重復序列。（2）序列比對（mapping）：將通過(guò)質(zhì)控后每一條read與參考基因組進(jìn)行比對，回貼到基因組上最佳位置。（3）變異鑒定：對每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行變異鑒定。在腫瘤panel測序中，主要檢測SNV和Indel兩種突變類(lèi)型，參數調整后可分析CNV。部分panel的設計還可以鑒定染色體易位。對于腫瘤panel基因測序數據，鑒定后的變異位點(diǎn)都需要進(jìn)行該位點(diǎn)可視化查看和確認，如TheIntegrativeGenomicsViewer（IGV）。（4）變異注釋?zhuān)夯谕ㄓ脭祿?，對突變基因位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋?zhuān)斠?jiàn)下文。
2.NGS生物信息分析流程質(zhì)量管理：實(shí)驗室應建立生物信息學(xué)程序/Pipeline的書(shū)面質(zhì)量管理（QM）計劃文件。必須包含每次運行時(shí)監測和評估運行性能的指標和質(zhì)控參數，以及定期（例如每月、每季度）監測的指標和質(zhì)控參數。指標和質(zhì)控參數可包括但不限于標準品的突變類(lèi)型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類(lèi)型和變異頻率的標準品進(jìn)行驗證，驗證其特異性和靈敏度是否達到實(shí)驗室要求。驗證結果簽名留底備案。（1）NGS數據存儲：實(shí)驗室需要在生物信息分析過(guò)程中對原始數據及最后的結果數據進(jìn)行標準化存儲，并要保存相應的年限以備查。（2）版本可追溯性：每份病例數據分析報告中，生物信息數據分析流程所涉及軟件、算法、參數及數據庫的版本必須可溯源。（3）異常記錄。實(shí)驗室需要建立一個(gè)異常記錄文檔，用來(lái)記錄偏離NGS生物信息分析標準分析流程的檢測。
3.NGS生物信息分析質(zhì)量指標：原始文件及比對結果文件的質(zhì)量指標見(jiàn)表1。
表1
4.NGS數據存儲格式標準：為了規范和管理各類(lèi)數據，各個(gè)實(shí)驗室需按照編號進(jìn)行數據管理，所有數據按照國際標準格式進(jìn)行存儲。必須建立本地變異數據庫（用于檢驗變異真實(shí)性）。
5.NGS數據存儲傳輸及共享安全標準：實(shí)驗室需要制定規章制度以確認測序數據在內部及外部存儲及傳輸過(guò)程中的安全性和機密性。正常人群的變異數據應該共享。
五、NGS結果解釋及報告
1.NGS臨床報告包含內容：基于高通量測序技術(shù)，臨床實(shí)驗室比較容易的獲取更高通量的臨床樣本檢測數據，不可避免會(huì )檢測到意義未知的變異位點(diǎn)，在實(shí)際工作中會(huì )有一定的不確定性。但NGS的檢測報告建議體現以下內容：
?。?）檢測名稱(chēng)，如XXX基因變異檢測報告。
?。?）患者基本信息，姓名，年齡，性別，住院號，送樣醫院科室及醫師等。
?。?）樣本信息，病理號，取材部位，樣本類(lèi)型（FFPE、新鮮、血液等）、送檢日期、報告日期等。
?。?）病理信息，腫瘤組織類(lèi)型、位置、TNM分期、細胞含量、腫瘤細胞比例、特殊說(shuō)明（出血、壞死、酸脫鈣處理等）。
?。?）檢測技術(shù)，包含所用基因panel、檢測平臺名稱(chēng)，分析軟件版本號等。
?。?）結果列表應包含，基因名稱(chēng)、變異在染色體位置、變異頻率、cDNA的Genbank號（NM開(kāi)頭）及符合人類(lèi)基因組變異協(xié)會(huì )（HumanGenomeVariationSociety,HGVS）書(shū)寫(xiě)規范的突變類(lèi)型、編碼蛋白Genbank號（NP開(kāi)頭）及突變類(lèi)型、雜合/純合狀態(tài)等。
?。?）臨床意義解讀和批注：體細胞突變，報告各個(gè)腫瘤檢測到的變異位點(diǎn)及臨床意義。胚系突變，對于檢測到的變異位點(diǎn)的致病性予以相應的臨床解釋。臨床意義解讀要客觀(guān)平實(shí)的描述，在疾病相關(guān)性只描述既往研究中的療效或預測，不能出現使用何種治療手段或策略的語(yǔ)言。
?。?）若檢測失敗，應闡述失敗原因。
?。?）最終報告應由檢測者、報告醫師或指定審核人聯(lián)合簽發(fā)。
2.基因變異的命名：在描述所檢測出的基因變異時(shí)要遵循一定的原則和規范，推薦使用人類(lèi)基因組變異協(xié)會(huì )命名指南（www.hgvs.org）。對于遺傳病相關(guān)基因變異命名，推薦美國醫學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院（AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics；https://www.acmg.net）的遺傳疾病變異分類(lèi)指導的命名、遺傳背景說(shuō)明以及權威文獻說(shuō)明。
3.臨床意義的解讀和批注：對于腫瘤體細胞突變，根據突變的類(lèi)型和已有的報道及指南，基因變異提倡分級的處理方式：
A級：美國食品藥品管理局（FDA）或中國食品藥品管理局（CFDA）批準的用藥治療靶點(diǎn)；寫(xiě)入中外診療指南有明確診斷/治療/預后意義的變異。在報告注釋該變異位點(diǎn)的臨床診斷/治療/預后意義的權威指南來(lái)源。
B級：尚未進(jìn)入診療指南，但已經(jīng)寫(xiě)入該領(lǐng)域的專(zhuān)家共識的變異位點(diǎn)。注釋時(shí)要批注研究報道及專(zhuān)家共識的來(lái)源，明確其
藥物及其臨床意義、正在開(kāi)展的狀態(tài)等信息。
C級：FDA或CFDA批準用于其他腫瘤可預測療效的基因變異，或者正在進(jìn)行中的臨床試驗變異位點(diǎn)。注釋時(shí)要批注用于其他腫瘤的權威指南，研究文獻及臨床試驗正在開(kāi)展的狀態(tài)等信息。
D級：處于學(xué)術(shù)爭議或臨床意義不明確的基因變異。同一實(shí)驗室應該有統一的政策用來(lái)應對檢測過(guò)程中出現的臨床意義不明變異情況。
對于以上幾種情況在報告的時(shí)候注意客觀(guān)平實(shí)地描述檢測的結果，在病理報告中不能出現建議使用何種治療手段或策略的語(yǔ)言。
對于遺傳疾?。╣ermlinemutation）檢測，除了中外診療指南及重要參考文獻以外，推薦兩個(gè)數據庫：OnlineMendelianInheritanceinMan（http://omim.org/）和美國醫學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院（https://www.acmg.net）的遺傳疾病變異分類(lèi)指導注釋臨床意義，并附上數據庫和參考文獻內容。遺傳注釋還可以參考各亞專(zhuān)科的專(zhuān)業(yè)數據庫進(jìn)行注釋?zhuān)ū热?a name='InnerLinkKeyWord' href='//m.gunswipe.com/nrzl/zlzhonglei/rxa/' target='_blank'>乳腺癌BRCA1/2基因等）。
4.意義不明位點(diǎn)的處理：由于通量的增加和人種差異，臨床腫瘤樣本可能發(fā)現新的變異位點(diǎn)。實(shí)驗室必須制定相關(guān)政策方案用來(lái)應對檢測過(guò)程中出現的臨床意義不明變異情況。政策可以是一發(fā)現變異就報告，但附上說(shuō)明和意義。也可以是不報道這些發(fā)現或只報道小部分變異結果，并附上說(shuō)明和參考文獻及數據庫。但是在報告的備注里一定要聲明本實(shí)驗室的報告規則。
5.知情同意：建議提供患者手寫(xiě)或在線(xiàn)版的知情書(shū)。
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