液相色譜法定量的依據

　　被測組分的量(W)與響應值(A)（峰高或峰面積）成正比,W=f×A。

　　定量校正因子(f)：是定量計算公式的比例常數，其物理意義時(shí)單位響應值（峰面積）所代表的被測組分的量。

　　由已知標準樣品的量和其響應值可以求得定量校正因子。

　　測定未知組分的響應值，通過(guò)定量校正因子即可求得該組分的量。

　　定量分析常用術(shù)語(yǔ)：

　　樣品（sample）：含有帶測物，供色譜分析的溶液。分為標樣和未知樣。

　　標樣（standard）：濃度已知的純品。

　　未知樣（unknow）：濃度待測的混合物。

　　樣品量（sampleweight）：待測樣品的原始稱(chēng)樣量。

　　稀釋度（dilution）：未知樣的稀釋倍數。

　　組分（componance）：欲做定量分析的色譜峰，即含量未知的被測物。

　　組分的量（amount）：被測物質(zhì)的含量（或濃度）。

　　積分（integerity）：由計算機對色譜峰進(jìn)行的峰面積測量的計算過(guò)程。

　　校正曲線(xiàn)（calibrationcurve）：組分含量對響應值的線(xiàn)性曲線(xiàn)，由已知量的標準物建立，用于測定待測物的未知含量。

　　常用的定量方法

　　1.外標法

　　標準曲線(xiàn)法，分為外標法和內標法。外標法在液相色譜中用的最多。內標法準確但是麻煩，在標準方法中用的最多。

　　用被測化合物的純品作為標準樣品，配制成一系列的已知濃度的標樣。注入色譜柱的到其響應值（峰面積）。

　　在一定范圍內，標樣的濃度與響應值之間存在較好的線(xiàn)性關(guān)系，即W=f×A，制成標準曲線(xiàn)。

　　在完全相同的實(shí)驗條件下，注入未知樣品，得到欲測組分的響應值。根據已知的系數f，即可求出欲測組分的濃度。

　　外標法的優(yōu)點(diǎn)：

　　操作、計算簡(jiǎn)單，是一種常用的定量方法；無(wú)需各組分都被檢出、洗脫；需要標樣；標樣及未知樣品的測定條件要一致；進(jìn)樣體積要準確。

　　外標法缺點(diǎn)：

　　實(shí)驗條件要求高，如檢測器的靈敏度，流速、流動(dòng)相組成的不能發(fā)生變化；每次進(jìn)樣體積要有好的重復性。

　　2.內標法

　　操作：

　　將已知量的內標樣加入標準樣品，制成混合標樣，并配制一系列的已知濃度的工作標樣?；旌蠘藰又袠藰优c內標樣的摩爾比不變。注入色譜柱，以（標樣峰面積/內標樣峰面積）為響應值。根據響應值與工作標樣濃度之間存在的線(xiàn)性關(guān)系，即W=f×A，制成標準曲線(xiàn)。

　　將已知量的內標樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測組分的響應值。根據已知的系數f，即可求出欲測組分的濃度。

　　內標法的特點(diǎn)：

　　操作過(guò)程中樣品和內標是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測組分與內標的量的比值恒定，上樣體積的變化不會(huì )影響影響定量結果。內標法抵消了上樣體積，乃至流動(dòng)相、檢測器的影響，因此比外標法精確。

　　案例分析

　　案例分析一

　　我做的是苯酚羥基化反應，產(chǎn)物中有苯酚，苯二酚（鄰，對），苯醌，焦油，用安捷倫1100液相色譜分析，外標法計算選擇性和轉化率。但一直以來(lái)，計算出的結果老是差強人意。偶爾算出一個(gè)好的結果，但是一重復又不行了，有時(shí)候重復做幾次都不一樣，很是郁悶。

　　最近又老算出來(lái)選擇性超過(guò)100%。開(kāi)始懷疑稀釋誤差的問(wèn)題（樣品是稀釋以后去測的)，但現在操作的時(shí)候非常小心了，懷疑標準曲線(xiàn)的問(wèn)題，但是重新做了好幾條了。結果就是很奇怪，自己想了想：

　　1.因為液相色譜儀是公用的，所以特意買(mǎi)了專(zhuān)用的色譜柱。但經(jīng)常測的時(shí)候發(fā)現柱壓不一樣，是不是因為這個(gè)影響了峰面積，進(jìn)而影響了結果？柱壓的影響這么大么？

　　2.是不是外標法就不準確？該用單點(diǎn)校正法？之前覺(jué)得每次測樣前都配一個(gè)標樣有點(diǎn)麻煩，所以沒(méi)用。

　　3.還是別的什么原因？

　　補充：用的柱子是ZORBAXSB-C18,用的甲醇：水=3：7，每個(gè)峰都分的很開(kāi)。取樣后離心去掉催化劑，再定量稀釋然后去測的。

　　網(wǎng)友七嘴八舌：

　　-有時(shí)候確實(shí)柱壓不同會(huì )對結果有影響，但這是柱壓差別很大的情況才會(huì )發(fā)生。是不是柱子沒(méi)沖洗好，或者需要看是否進(jìn)氣泡了，因為這都可能導致結果不準。

　　-如果柱壓的差別很大的話(huà)，比如30bar已經(jīng)很大了，平時(shí)用的時(shí)候，有柱溫箱，一般都控制溫度恒定的，基本同意條件不會(huì )有這么大的變化，最多10bar上下浮動(dòng)，通常小于5bar。

　　-是不是走過(guò)緩沖鹽的流動(dòng)相？用水低流速長(cháng)時(shí)間沖洗，再換乙腈沖洗試試看。是不是有些不物殘留在柱子中沒(méi)有及時(shí)沖洗導致柱壓偏高，可以嘗試用異丙醇試試。

　　-柱壓變化主要會(huì )影響保留時(shí)間，對峰面積影響不大。你所說(shuō)的重復性不好，是液相進(jìn)同一個(gè)樣品重復不好還是不同的樣品。如果不同的樣品那是你反應的問(wèn)題。至于選擇性超過(guò)100%？是否是計算方法錯誤？

　　-簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，計算苯二酚的選擇性：

　　假設對苯峰面積代入標準曲線(xiàn)得濃度C1(g/ml)；鄰苯峰面積對應濃度C2，苯酚峰面積對應濃度C，溶液總體積V，稀釋倍數20，初始苯酚加入量m(g),如下

　　-計算公式如果沒(méi)錯，可以看看是否自己沒(méi)有做過(guò)空白以及反應投料時(shí)的組分測試。

　　-至于單點(diǎn)還是外標法？

　　單點(diǎn)校正比較簡(jiǎn)單，如果要求不是很?chē)栏竦脑?huà)，單點(diǎn)校正可以滿(mǎn)足要求。單點(diǎn)標準濃度如果在被測樣品濃度附近，結果比外標法更準確。做考核樣時(shí)，我們一般先用外標法定出大致濃度范圍，再以單點(diǎn)法定量。

　　單點(diǎn)一般適用于線(xiàn)性曲線(xiàn)截距在100%濃度點(diǎn)2%以下的。高于20%不能采用單點(diǎn)校正和外標。外標法對照和拱式樣品濃度應一致，校正曲線(xiàn)線(xiàn)性符合即可。

　　案例分析二

　　我想用液相色譜進(jìn)行定量分析，使用外標法。問(wèn)題是：標準曲線(xiàn)是不是每次測定樣品時(shí)都要做一次？我有200個(gè)樣品，但不是一次能做好，每次我可以測20個(gè)樣品。難道我每次測定前都要先做一下標準曲線(xiàn)？我是同一臺儀器，同一條件。

　　網(wǎng)友七嘴八舌：

　　從嚴格意義上來(lái)講應該是每天做一條標準曲線(xiàn)。如果你做的東西要求不是太嚴格（不需要報批），可以考慮隔幾天做一天標曲。不可否認的是，每天都做標準曲線(xiàn)能減小測量的數據的誤差。

　　但是如果是藥品檢測，是應該每次開(kāi)機測定樣品前做一條標準曲線(xiàn)或單點(diǎn)校正標準溶液分析，但普通化工分析要求不嚴就沒(méi)有必要每次做曲線(xiàn)，因為差異不大的。但如果是檢測單位檢測樣品，就要根據標準來(lái)執行了。說(shuō)白了其實(shí)是規范不規范的問(wèn)題。