基因工程技術(shù)處理的T細胞將腫瘤抗體特異性識別和共刺激信號結合，具有非MHC依賴(lài)性的腫瘤抗原特異性識別、增殖和殺傷能力。近年來(lái)，MM抗原特異性的嵌合抗原受體修飾的T細胞（chimericantigenreceptor，CAR-T細胞）研究也陸續開(kāi)展并獲得初步成效。CAR-T細胞治療成為有效治療多發(fā)性骨髓瘤的新方案。

　　多發(fā)性骨髓瘤（MM）是骨髓惡性漿細胞克隆增殖性疾病，導致骨髓造血受抑和溶骨性疾病。盡管應用傳統化療和造血干細胞移植以及靶向性藥物治療骨髓瘤，MM仍然不能完全治愈。其中一個(gè)重要原因就是隨著(zhù)疾病進(jìn)展而出現的免疫缺陷和免疫耐受。天然免疫系統中，MM患者NK細胞的細胞毒性和免疫調節功能都受到削弱，腫瘤相關(guān)性巨噬細胞被激活并分泌炎性因子如TNF-α、IL-6等促進(jìn)MM細胞生長(cháng)。MM患者中的抗原提呈細胞樹(shù)突細胞吞噬細菌和抗原提呈能力下降，不能被腫瘤抗原有效刺激并上調T細胞活化的共刺激信號分子。獲得性免疫系統中，MM患者的T細胞和B細胞的功能都被削弱，MM細胞和MM來(lái)源的骨髓基質(zhì)細胞促使Treg/Th17平衡向Th17漂移，而Th17細胞具有免疫抑制功能并能促進(jìn)腫瘤生長(cháng)。T細胞治療能有效殺傷腫瘤細胞，分泌大量促炎細胞因子從而改善MM患者的免疫功能。

　　CAR-T細胞的結構和功能

　　嵌合抗原受體由胞外抗原結合區[由來(lái)源于單克隆抗體的輕鏈（VL）和重鏈（VH）組成，中間由帶韌性的絞鏈區連接形成單鏈抗體（scFv）]、跨膜區域和胞內信號轉導區構成。CAR-T細胞的特殊結構決定了CAR-T細胞可以識別除了多肽段的廣泛腫瘤抗原，包括神經(jīng)節苷脂、有機糖類(lèi)抗原等，并且識別腫瘤抗原的過(guò)程不受MHC分子的限制，胞內區域提供T細胞活化所需的共刺激分子，從而促進(jìn)T細胞增殖，分泌促炎細胞因子，抗細胞凋亡等。

　　CAR-T細胞在MM治療中的應用

　　1．CD19

　　MM的異常漿細胞幾乎不表達CD19，但是仍有一群低分化的CD19陽(yáng)性細胞與耐藥和疾病進(jìn)展有關(guān)?；谶@群與MM密切相關(guān)的CD19亞群，針對CD19的CART細胞（CTL019）治療難治復發(fā)性MM已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗（NCT02135406，美國賓夕法尼亞）。采用流式細胞術(shù)檢測來(lái)源于復發(fā)MM患者的骨髓漿細胞，發(fā)現少量的CD19陽(yáng)性細胞群，同時(shí)表達κ輕鏈和B細胞成熟抗原（B-cellmaturationantigen，BCMA），表現出惡性漿細胞的特性?；颊咴诮邮荞R法蘭和自體造血干細胞移植（ASCT）后給予CTL019細胞治療，體內單克隆免疫球蛋白（M蛋白）濃度和免疫球蛋白重鏈基因表達水平下降、IL-6下調伴隨IFN-γ上調。10例接受臨床試驗的患者中有6例保持完全緩解，CTL019的不良反應主要為1級細胞因子釋放綜合征和ASCT引發(fā)的小腸結腸炎。由于患者接受了ASCT，CAR-T細胞治療后的成效不排除ASCT的作用。

　　2．細胞膜表面糖蛋白（CS1）

　　CS1又被稱(chēng)作信號淋巴細胞激活分子（signalinglymphocyticactivationmolecule7，SLAM7），MM細胞高表達CS1，而正常免疫細胞包括NK細胞、T細胞的某些亞群和正常B細胞都低表達CS1，骨髓細胞幾乎不表達CS1。CS1誘導腫瘤生長(cháng)相關(guān)通路，并且促進(jìn)CD138+MM細胞與骨髓基質(zhì)細胞的黏附，發(fā)揮促腫瘤作用。在對傳統化療敏感或者耐藥的患者中，以CS1為靶點(diǎn)的單克隆抗體和DC疫苗能誘導強烈的抗體依賴(lài)細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應，并抑制MM細胞對骨髓基質(zhì)細胞的黏附。在此基礎上，以單克隆抗體為結構基礎的CAR-T細胞治療也具有可行性，且可避免單克隆抗體引起的免疫復合物沉積。有研究者將anti-CS1-scFv-CD28-CD3ζ片段插入逆轉錄病毒基因組，然后再轉導進(jìn)T細胞形成CS1-CAR-T細胞，發(fā)現這些CAR-T細胞對高表達CS1的MM細胞系有很強的殺傷作用，細胞活化標志CD69表達增高，脫顆粒作用增強，高表達IL-2和IFN-γ。同時(shí)將其應用于MM.1S免疫缺陷小鼠模型中，結果顯示CS1-CAR-T細胞治療后可發(fā)揮抗腫瘤作用，延長(cháng)模型小鼠的生存期。

　　3．BCMA

　　BCMA表達于MM細胞，而漿細胞和成熟B細胞低表達或者不表達BCMA。BCMA屬于TNF受體超家族，結合B細胞活化因子（B-cellactivatingfactor，BAFF）以及增殖誘導配體（proliferation-inducingligand，APRIL），進(jìn)而促進(jìn)MM細胞生長(cháng)和骨髓基質(zhì)細胞的黏附，BCMA抗體對MM細胞系和原代MM細胞都具有殺傷作用。BCMA缺陷小鼠的B細胞數量正常，但B細胞功能受到抑制。上述研究結果提示BCMA適合作為MM治療的靶點(diǎn)，并不會(huì )引起正常B細胞的功能受到明顯影響。融合C12A3.2或者C11D5.3的BCMA-CAR-T細胞，分別以BCMA-1和BCMA-2為靶點(diǎn)，與BCMA陽(yáng)性的MM細胞共培養后表現出明顯的反應性增殖和殺傷活性，并且高表達IFN-γ。BCMACAR-T細胞能識別并殺傷MM患者來(lái)源的MM細胞，在MM模型小鼠體內通過(guò)穿孔素途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

　　4．免疫球蛋白輕鏈

　　B細胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和慢性B淋巴細胞白血?。˙-CLL）中，惡性細胞分泌κ鏈或者λ鏈，體內包含κ鏈或者λ鏈的抗體在功能上無(wú)明顯差異，對κ鏈缺陷小鼠研究表明κ鏈缺陷并不導致對病原體體液免疫的明顯下調和易感性的上調。在MM患者中，只表達κ輕鏈型者的MM細胞表面單克隆κ輕鏈抗原的陽(yáng)性檢出率為70%，λ游離輕鏈型者的MM細胞表面未檢測到單克隆κ輕鏈抗原。Hutchinson等發(fā)現B細胞亞群中CD19+CD27++CD38++細胞表達κ輕鏈抗原而其他B細胞亞群不表達該抗原。上述研究結果提示κ輕鏈抗原可以作為MM免疫治療的靶點(diǎn)，并不會(huì )引起免疫功能紊亂。

　　κ輕鏈抗原的單克隆抗體MDX-1097通過(guò)ADCC作用殺傷MM細胞，來(lái)那度胺通過(guò)上調MM細胞表面κ輕鏈抗原的表達增強MDX-1097的作用。當可溶性κ輕鏈抗原達到較高濃度（>250μg/ml）時(shí)，MDX-1097仍可選擇性結合靶細胞，說(shuō)明MDX-1097優(yōu)先結合靶細胞。Ⅱ期臨床試驗中MDX-1097單藥治療可以誘導部分緩解，血清中κ輕鏈抗原和M蛋白的水平明顯下降，10例MM患者6個(gè)月無(wú)疾病進(jìn)展，部分3級不良反應包括心臟傳導阻滯，肺炎等與MDX-1097無(wú)關(guān)。因此，以該單克隆抗體為基礎的CAR-T細胞也會(huì )優(yōu)先結合靶細胞，不受高濃度游離抗原的影響，與來(lái)那度胺協(xié)同有效殺傷MM細胞，誘導MM患者緩解。以惡性B細胞表面κ輕鏈抗原為靶點(diǎn)的46/28ζ+-CAR-T細胞在體外特異性殺傷κ+腫瘤細胞系，含有可溶性游離Igκ+的血漿不影響其殺傷效率。46/28ζ+-CAR-T細胞體外可以殺傷自體和同種異體B-CLL的惡性B細胞，并分泌大量IL-2，TNF-α和IFN-γ，在小鼠模型體內也有持續的46/28ζ+-CAR-T細胞增殖和抗腫瘤效應。對難治復發(fā)性NHL、CLL和MM的κ輕鏈CAR-T細胞治療臨床試驗已在美國休斯頓開(kāi)展（NCT00881920）。

　　5．LewisY

　　LewisY抗原是結合于Ⅱ型血型寡糖鏈的四糖結構，與多種惡性腫瘤的發(fā)生和預后相關(guān)，包括肺癌、大腸癌等。臨床研究證實(shí)以L(fǎng)ewisY為靶點(diǎn)的單克隆抗體在上皮性腫瘤的治療中安全、有效。Peinert等研究發(fā)現漿細胞惡變時(shí)會(huì )異常表達上皮性腫瘤抗原。隨后，Peinert等發(fā)現急性髓系白血?。ˋML）細胞系KG-1a、K562細胞以及MM細胞系RPMI8226-13細胞高表達LewisY，該研究中52%的MM患者和46%的AML患者表達LewisY，而CLL患者LewisY抗原表達陰性；以L(fǎng)ewisY為靶點(diǎn)的Anti-LeY-scFv-CD28-ζ轉導的T細胞（LeY-CAR-T細胞）對RPMI8226-13細胞和原代MM細胞表現出特異性的增殖殺傷活性和反應性的IL-2和IFN-γ促分泌作用，且殺傷活性與LeY的表達水平成正相關(guān)。流式細胞術(shù)檢測顯示LeY-CAR-CD8+T細胞有中央記憶性T細胞和效應記憶性T細胞亞群的分化，LeY-CAR-CD8+T細胞能夠在體內發(fā)揮長(cháng)期的抗MM作用。在高表達LewisY的小鼠模型中，LeY-CAR-T細胞治療組生存期較對照組明顯延長(cháng)。在臨床前實(shí)驗結果的基礎上開(kāi)展了LeY-CAR-T細胞對預后較差的MM和AML患者的Ⅰ期臨床試驗（NCT01716364，澳大利亞墨爾本）。

　　6．食管鱗狀細胞癌抗原（NY-ESO-1）

　　多種惡性腫瘤高表達NY-ESO-1，包括黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等，而正常組織不表達或者低表達NY-ESO-1。在60例MM患者中，35例（60%）患者在基因和蛋白水平檢測出NY-ESO-1陽(yáng)性表達，在細胞遺傳學(xué)異常和復發(fā)的MM患者中NY-ESO-1的表達水平更高，提示NY-ESO-1與MM的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。NY-ESO-1是腫瘤/睪丸抗原（cancer/testisantigens）中最具免疫原性的抗原，能夠在體內外誘導抗原抗體反應和特異性CTL。NY-ESO-1在多種腫瘤中表達升高的機制還有待研究，但是可以肯定的是NY-ESO-1高表達提示預后較差。所以，以NY-ESO-1為靶點(diǎn)的CAR-T細胞可以作為MM治療的有力手段。識別NY-ESO-1157-165肽段和HLA-A*0201的CAR-T細胞（HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細胞）中，40%的細胞為不表達CCR7的效應T細胞，5%為CCR陽(yáng)性的記憶性T細胞，后者能在特異性抗原的刺激下重新分化為效應細胞，并分泌IL-2。臨床前期實(shí)驗證實(shí)了HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細胞的靶向治療作用，并誘導免疫記憶，有望進(jìn)行下一步的臨床實(shí)驗。對該CAR-T細胞的胞外抗體結合區（HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165）的抗獨特型抗體FabA4能夠結合抗HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細胞，并以NY-ESO-1陽(yáng)性細胞相似的方式活化T細胞，與NY-ESO-1157-165游離肽段相比，刺激CAR-T細胞增殖的能力更強。HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細胞對高表達NY-ESO-1的腫瘤細胞具有特異性的殺傷作用，但是某些乳腺癌細胞和MM細胞低表達NY-ESO-1，限制了該CAR-T細胞的應用。NY-ESO-1的表達與啟動(dòng)子區域的去甲基化有關(guān)，而5-aza-2′-deoxycytidine（DAC）這種去甲基化的藥物能夠顯著(zhù)提高U266細胞中NY-ESO-1基因和蛋白水平的表達，并促進(jìn)HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細胞分泌細胞因子和對腫瘤的殺傷作用?？躬毺匦涂贵wFabA4和去甲基化藥物DAC都能進(jìn)一步提高HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細胞的效率。

　　7．CD138、CD38和CD56

　　CD138、CD38和CD56通常共同表達在MM細胞表面，在一項對306例MM患者的臨床研究中，結果顯示CD138、CD38和CD56的陽(yáng)性檢出率分別為100%、100%和78.7%，CD138作為MM的基本診斷指標，與腫瘤生長(cháng)和MM疾病進(jìn)展密切相關(guān)。CD138-CAR-T細胞聯(lián)合泊馬度胺體外殺傷RPMI8226和U266細胞，并誘導IFN-γ分泌。解放軍總醫院開(kāi)展了CD138的CAR-T細胞靶向治療的臨床實(shí)驗（NCT01886976），但目前尚無(wú)完整的數據。細胞表面的CD38活化后促進(jìn)細胞底物的磷酸化激活NF-κB信號通路，而NF-κB信號通路與MM細胞的耐藥密切相關(guān)。CD56是MM特異性的指標，隨著(zhù)疾病進(jìn)展CD56的缺失提示MM的髓外浸潤和漿細胞白血病。以CD38為靶點(diǎn)的CAR-T細胞（CD38-CAR-T細胞）在體外特異性殺傷MM細胞系細胞和原代MM細胞，CD56-CAR-T細胞（5×106）可有效清除MM模型小鼠的腫瘤[33，34]。但是CD138、CD38和CD56也表達于某些正常細胞上，如CD138表達于支氣管上皮細胞，CD38表達于造血干細胞、NK細胞、樹(shù)突細胞等，CD56表達于中樞神經(jīng)元和NK細胞。如何避免CD138、CD38和CD56的CAR-T細胞對正常組織細胞的不良反應是下一步研究的方向。

　　8．NK細胞活化受體NKG2D

　　NKG2D受體是NK細胞和T細胞的活化受體，其配體為MICA、MICB、ULBP1-3和Letal（ULBP4），表達于多種腫瘤細胞，包括淋巴瘤、白血病和MM。原代MM細胞和多種MM細胞系細胞均可表達NKG2D的配體，包括MICA和ULBPs。正常組織細胞不表達NKG2D的配體，當發(fā)生DNA損傷，感染或者惡變時(shí)才合成該配體。以患者和健康人的T細胞合成NKG2D-CART細胞，兩者均以穿孔素的方式殺傷MM細胞，并且分泌IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和趨化因子CCL5，NKG2D-CAR-T細胞對MM患者的骨髓樣本中少量的MM細胞都具有反應性IFN-γ分泌，采用流式細胞術(shù)檢測NKG2D-CAR-T細胞，結果顯示主要是表達CD27、CCR7、CD26L和高表達CD45RO的效應T細胞。游離的MICA分子通過(guò)下調NK細胞和T細胞NKG2D的表達抑制兩種細胞對腫瘤的反應性，但該小組研究表明NKG2D-CAR-T細胞在較高的MICA濃度（>1.5×106pg/ml）時(shí)才會(huì )受到抑制。在小鼠5T33MM模型中，NKG2D-CAR-T細胞組生存期顯著(zhù)優(yōu)于對照組，在注射N(xiāo)KG2D-CAR-T細胞1d后，骨髓和脾臟中都檢測到CAR-T細胞，并且小鼠血清中IFN-γ也隨之升高。小鼠體內CD4+和CD8+T細胞細胞活化標志CD69表達上調，對再次注射5T33MM細胞表現出免疫反應，說(shuō)明NKG2D-CAR-T細胞能在體內誘導免疫細胞的活化和免疫記憶T細胞。有研究表明NKG2D-CAR-T細胞可以下調體內Treg細胞數量，并且誘導骨髓細胞成為促進(jìn)免疫的細胞亞型。蛋白酶體抑制劑硼替佐米、馬法蘭、多柔比星通過(guò)影響DNA損傷途徑上調原代MM細胞NKG2D配體的表達，而沙利度胺和地塞米松沒(méi)有這種效應，基于這個(gè)機制聯(lián)用這些藥物可能增強NKG2D-CAR-T細胞對MM細胞的識別從而提高殺傷效率。

　　9．CD44的異構體6（CD44v6）

　　CD44在造血系統腫瘤和上皮性腫瘤中選擇性高表達，被認為是腫瘤干細胞的標記之一。轉導了BCR-ABL基因的CD44-/-的造血干細胞不能誘導小鼠白血病的發(fā)生，CD44特異性單克隆抗體成功消除小鼠體內的AML干細胞，防止AML的發(fā)病。意義未明單克隆免疫球蛋白血癥和MM患者來(lái)源的CD138+漿細胞均表達CD44v6，并且隨著(zhù)疾病進(jìn)展表達陽(yáng)性率也升高，CD44v6與13q14染色體缺失具有相關(guān)性，CD44v6在胰腺、乳腺、頭頸部組織惡變中也起到關(guān)鍵作用。造血干細胞不表達CD44v6，在活化的T細胞、單核細胞、角質(zhì)細胞也均呈低表達，使得CD44v6成為合適的CAR-T細胞靶點(diǎn)。CD44v6.CAR28z+T細胞體外殺傷表達CD44v6的MM細胞，流式細胞術(shù)檢測結果顯示CD44v6.CAR28z+T細胞中分化出表達IL-7Rα和CXCR4的記憶性T細胞亞群。來(lái)源于患者具有免疫負調節活性的骨髓間充質(zhì)干細胞不影響CD44v6.CAR28z+T細胞的殺傷活性，體內外實(shí)驗證明CD44v6.CAR28z+T細胞不會(huì )攻擊正常角質(zhì)細胞，不良反應僅限于可逆性的單核細胞減少。