BMS和Merck藥廠(chǎng)PD-1抗體藥物的上市，將腫瘤免疫，尤其是免疫檢查點(diǎn)抗體藥物的研發(fā)帶進(jìn)了一個(gè)新紀元。腫瘤免疫治療是國內外眾多藥企積極投入的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域。預計將來(lái)70％以上的腫瘤可以通過(guò)抗體藥物得到治愈。與此同時(shí)，中國醫藥企業(yè)有可能在腫瘤免疫抗體藥物研發(fā)領(lǐng)域實(shí)現彎道超車(chē)。

　　與小分子藥物不同，抗體藥物研發(fā)由于靶點(diǎn)明確，研發(fā)過(guò)程更有方向性和可控性。聯(lián)合用藥以及雙特異性抗體研發(fā)在今后5年會(huì )非常熱鬧且競爭激烈。由于免疫檢查點(diǎn)抗體藥物是通過(guò)調節免疫系統進(jìn)行腫瘤治療，所以，動(dòng)物體內實(shí)驗是驗證和評價(jià)這類(lèi)藥效的最佳途徑，尤其是聯(lián)合用藥及雙特異性抗體藥物藥效評價(jià)。

　　在選擇體內藥效評價(jià)模型方面，小鼠無(wú)疑是最常用的動(dòng)物模型。首先，小鼠的繁殖快，可以快速得到有統計學(xué)意義的同周齡、同性別、且足量的小鼠；第二，有足夠多的近交系小鼠腫瘤細胞系可以使用；第三，容易建立較穩定的動(dòng)物－腫瘤模型體系，建立標準化的藥效評價(jià)平臺。

　　然而，通過(guò)比較可以發(fā)現，普通小鼠的免疫檢查點(diǎn)基因與對應的人類(lèi)基因之間，在蛋白氨基酸序列上同源性一般在60%左右。所以，一般情況下識別人蛋白的抗體，并不識別小鼠相應基因蛋白。也就是說(shuō)，我們一般不能用普通小鼠來(lái)評價(jià)抗人蛋白抗體的藥效。這就需要對小鼠的免疫檢查點(diǎn)基因進(jìn)行人源化改造。比如，將小鼠的PD1基因胞外部分換成人的對應部?？梢钥吹?，人源化之后的小鼠可以用來(lái)做anti-humanPD1抗體的藥效評價(jià)。

　　1）小鼠品系：這個(gè)是首先要考慮的。這個(gè)可以根據我們將來(lái)用什么腫瘤細胞系做研究，來(lái)決定采用什么品系的小鼠來(lái)做基因人源化。比如我們要用MC38、B16F10、LLC1等C57BL/6遺傳背景的腫瘤細胞系，就一定要在C57BL/6遺傳背景的小鼠上做基因改造。（這個(gè)大家可以理解，這與配型不對的人之間不能做器官移植是一個(gè)道理）。

　　這個(gè)稍微提一下的是，如果用胚胎干細胞(ESC)來(lái)打靶的話(huà)，一定要用純系C57BL/6遺傳背景的ESC來(lái)打靶。如果用129或129/B6背景的ESC做打靶，就需要用C57BL/6小鼠來(lái)回交10代以上，否則實(shí)驗結果會(huì )很不穩定。腫瘤細胞在這種小鼠上接種之后，即使不做抗體處理，腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)也會(huì )是鐘型，也就是說(shuō)到后期會(huì )縮下來(lái)。而且個(gè)體之間腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)差異很大。而用純系的C57BL/6做的人源化小鼠，腫瘤會(huì )越長(cháng)越快，直到小鼠不能承受。而且不同個(gè)體之間腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)較一致。

　　2）設計考慮：在設計的時(shí)候，需要考慮信號傳遞（signaltransduction)。對于免疫細胞，信號傳遞包括蛋白受體胞外部分與配體結合、通過(guò)穿膜區與其它蛋白聚合形成復合物、以及通過(guò)胞內區的特定domain(ITAM，ITAM等)跟下游蛋白進(jìn)行結合并輸送信號等。為了不影響目標蛋白的信號傳遞，我們的default設計一般是只替換胞外部分，而保留小鼠基因的穿膜區和胞內區。

　　我們的default打靶方案一般是在基因組上直接替換，而不建議將人基因的cDNA（或人鼠嵌合cDNA)插入到小鼠的起始密碼子ATG的位置。因為我們發(fā)現這種方式有很大概率蛋白表達水平太低或沒(méi)有表達，同樣造成實(shí)驗結果的不穩定。

　　3）雙敲進(jìn)小鼠：聯(lián)合用藥以及雙特異性抗體藥效評價(jià)會(huì )非常依賴(lài)于雙基因敲進(jìn)小鼠。如果兩個(gè)基因不在同一條染色體上，我們一般先分別進(jìn)行打靶，然后再將單基因敲進(jìn)人源化小鼠進(jìn)行交配，得到雙人源化小鼠。在這個(gè)過(guò)程中，一定要驗證每一個(gè)單基因人源化小鼠是正確而有功能的。制備雙基因人源化小鼠，在小鼠品系的選擇上將更加關(guān)鍵。如果采用CRISPR方法在C57BL/6上做打靶，一般不會(huì )有什么問(wèn)題。但是，如果利用ESC來(lái)做打靶，需要特別注意的是ESC的遺傳背景一定是C57BL/6。否則漫長(cháng)的回交過(guò)程需要幾年時(shí)間。如果任何一個(gè)單人源化小鼠的回交代次不夠，就會(huì )使得雙人源化小鼠的遺傳背景更加混亂，實(shí)驗結果更加不穩定。