生物類(lèi)藥物發(fā)展現狀

　　自2000年以來(lái)，生物藥物市場(chǎng)平均每年以10%以上的增長(cháng)率發(fā)展，這一趨勢將持續到2020年甚至到更長(cháng)的時(shí)間。最近生物藥物市場(chǎng)最暢銷(xiāo)的前10種藥物中，大概有7~8個(gè)是生物類(lèi)藥物，其中大部分是抗體藥物。由此可知，生物類(lèi)藥物（抗體藥物）主導了藥物發(fā)展趨向。

　　從最近15年中國單抗藥物申報數量趨勢圖來(lái)看，從2000年到2010年，每年申報數量不超過(guò)5個(gè)，這一時(shí)期生物類(lèi)藥物發(fā)展緩慢；從2010年起，申報數量急劇上升；2015年，申報數量達到40多個(gè)。單抗藥物僅僅是生物類(lèi)藥物的一種，由此可知，近年來(lái)生物藥物蓬勃發(fā)展。

　　生物藥物研發(fā)與個(gè)性化醫療藥物

　　藥物分類(lèi)

　　1)普通化學(xué)小分子藥物：臨床應用最多的一種藥物，如阿司匹林、青霉素、Taxol（抗腫瘤藥物）等；

　　2)單抗類(lèi)藥物：如胰島素、白介素、抗體等；

　　3)病毒疫苗：如VLP、Polio等；

　　生物藥物創(chuàng )新研發(fā)關(guān)鍵技術(shù)

　　抗體類(lèi)藥物：新靶點(diǎn)的尋找；免疫毒素（ADC）的研究；雙特異、多特異免疫雜合蛋白的研究；

　　細胞因子：白介素、融合蛋白、長(cháng)效化細胞因子等藥物的發(fā)現；與受體共表達的細胞因子藥物；細胞因子本身作為佐劑的研發(fā)；

　　新型重組疫苗：新型抗原、新型佐劑的研發(fā)以及大規模生產(chǎn)；

　　生產(chǎn)技術(shù)：連續生產(chǎn)、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制以及一次性技術(shù)的應用。

　　個(gè)性化醫療藥物

　　對于不同的患者，特定疾病的發(fā)生機理可能不同，因此針對特定疾病的治療藥物并不是對每一個(gè)患有該疾病的患者都有效果。這可能導致同樣的疾病需要不同的藥物來(lái)治療，增加了藥物開(kāi)發(fā)的多樣性。個(gè)性化醫療藥物的開(kāi)發(fā)就是基于這樣的情況，來(lái)開(kāi)發(fā)正確的藥物在正確的時(shí)間治療對應的疾病。

　　瞬時(shí)表達技術(shù)在生物藥物研發(fā)中的應用

　　蛋白藥物基因表達有兩種技術(shù)，瞬時(shí)表達技術(shù)與穩定表達技術(shù)。

　　瞬時(shí)表達技術(shù)可以加速藥物前體中有效藥物的篩選，從而加快了新藥物的開(kāi)發(fā)。從資源、時(shí)間和產(chǎn)品質(zhì)量方面看，瞬時(shí)表達技術(shù)都優(yōu)化了藥物研發(fā)過(guò)程，該技術(shù)極大地縮短了蛋白藥物從臨床前到臨床階段的開(kāi)發(fā)時(shí)間。

　　瞬時(shí)表達技術(shù)與穩定表達技術(shù)的異同點(diǎn)

　　1)工藝步驟差別較大：穩定表達技術(shù)步驟較多，從細胞株的選擇到克隆，再到穩定性鑒定，需要進(jìn)行眾多復雜操作；瞬時(shí)表達技術(shù)簡(jiǎn)單方便，僅僅只需要將DNA與細胞混合進(jìn)行轉化即可；

　　2)時(shí)間不同：采用瞬時(shí)表達技術(shù)僅需1-2個(gè)月即可；穩定表達技術(shù)則需要1年甚至更長(cháng)的時(shí)間。

　　3)最終產(chǎn)品差別不大：無(wú)論是采用瞬時(shí)表達技術(shù)還是穩定表達技術(shù)，藥物蛋白的產(chǎn)量、質(zhì)量均基本沒(méi)有區別，最大的影響因素還在于細胞株的選擇。

　　相關(guān)研究文獻表明，無(wú)論是在規模上還是在表達量方面，瞬時(shí)表達技術(shù)已經(jīng)都達到了臨床藥物研發(fā)的標準要求。

　　藥物篩選方法（以IGFBP7為例）

　　第一步，利用多種信號肽、啟動(dòng)子以及增強子的不同組合設計蛋白表達調控序列，并通過(guò)檢測不同方案的5‘端UTR表達量，最終篩選出表達量效果最佳的方案。

　　第二步，使用westernblotting以及RP-HPLC方法鑒定表達效果；

　　第三步，表達蛋白的純化，通常采用常規分離手段實(shí)現快速表達純化；

　　第四步，驗證藥品蛋白的活性、分子量、質(zhì)量以及濃度等一系列的藥物臨床應用參數，以確保藥物的應用性。

　　CRISPR/Cas9技術(shù)的原理及應用

　　CRISPR/Cas9技術(shù)特點(diǎn)

　　重組效率高、簡(jiǎn)單，并可進(jìn)行敲除敲入等操作；

　　可以建立具有多重突變的動(dòng)物模型，在動(dòng)物體內治療遺傳疾??；

　　可在人類(lèi)干細胞中進(jìn)行突變，改正缺陷；

　　可修改人工精子的基因；

　　可在大動(dòng)物豬中敲除某些基因；

　　在CHO細胞中敲除FUT8基因（糖基化基因），產(chǎn)物沒(méi)有Fucose，增加了攻擊癌癥細胞的腫瘤細胞毒性（ADCC）；

　　在CHO細胞中敲入基因，可在高表達位置進(jìn)行定點(diǎn)表達；

　　CRISPR/Cas9技術(shù)藥物開(kāi)發(fā)應用原理

　　使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CHO細胞的FUT8基因（糖基化基因）后，在生產(chǎn)抗體藥物的過(guò)程中就可以去除Fucose，使細胞失去引導蛋白糖基化修飾的能力，從而加強了抗體藥物本身對于癌細胞的攻擊能力，但并不會(huì )改變抗體本身對于癌細胞的親和力。

　　除了敲除細胞基因外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)還可以向細胞中定點(diǎn)敲入一些抗體表達相關(guān)基因，從而輔助藥物研發(fā)。

　　抗體產(chǎn)品的創(chuàng )新方法

　　第一代生物藥物的開(kāi)發(fā)

　　1982-1990年，分子生物學(xué)以及雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了一系列初期抗體藥物，此期間的藥物大多為鼠源蛋白，例如Humulin等。

　　第二代生物藥物的開(kāi)發(fā)

　　利用截短、人源化、點(diǎn)突變、融合技術(shù)、糖基化技術(shù)以及多聚化等多種新技術(shù)，通過(guò)改變藥物的免疫源性和藥代動(dòng)力學(xué)特性、增強藥物對于靶細胞親和力、優(yōu)化生產(chǎn)流程等方法改造第一代藥物，從而產(chǎn)生了第二代生物藥物。由于氨基酸的改變，第二代生物藥物半衰期增加，長(cháng)效性增強，比如可以增強造血功能EPO，在增加2個(gè)糖基化氨基酸后，半衰期增加了3倍。

　　單克隆抗體：抗體中人源序列越多，親和性越高。第二代生物藥物基本由鼠源變?yōu)槭笕嗽辞逗象w甚至完全轉變?yōu)槿嗽纯贵w，實(shí)現了鼠源蛋白藥物向人源蛋白藥物的轉變，現在的單克隆抗體基本為人源化的抗體。TNF、EGF受體等新靶點(diǎn)的發(fā)現，擴大了新藥篩選的選擇。

　　抗體片段藥物：抗體片段本身可以作為藥物來(lái)開(kāi)發(fā)，例如雷珠單抗。

　　雙特異性抗體：這類(lèi)是對兩個(gè)抗原同時(shí)有親和力的抗體，現階段做整個(gè)分子抗體還存在困難，在工藝上很難完全達到輕重鏈構象正確折疊以及配對。Cell、PNAS等多種雜志都有相關(guān)報道，國際上雙特異性抗體是研究熱點(diǎn)。在臨床上，淋巴瘤、前列腺癌、胃腸道瘤等癌癥的藥物都在研發(fā)中。

　　提問(wèn)環(huán)節

　　1、今年微生物組學(xué)又開(kāi)始興起，用微生物表達藥物是否也會(huì )有一個(gè)比較大的利好，具體有哪些？

　　朱建偉院長(cháng)：微生物作為表達抗體藥物的宿主這種方案是可行的。但由于微生物缺乏對蛋白分子糖基化修飾功能，所以還不能直接表達全抗體，但可以生產(chǎn)抗體片段。

　　2、用微生物或病毒表達腫瘤疫苗的可行性以及未來(lái)趨勢是？

　　朱建偉院長(cháng)：長(cháng)久以來(lái)，病毒一直被認為是危險品，連許多大公司都不愿意冒險來(lái)開(kāi)發(fā)病毒疫苗。2013年，FDA才批準第一種病毒藥物上市。目前，病毒甚至微生物都正在被重視起來(lái)，不僅可以應用到腫瘤疫苗中，還可以應用到腫瘤的免疫治療中。

　　3、腫瘤疫苗是否存在大部分腫瘤都可以解決的途徑？

　　朱建偉院長(cháng)：我認為是存在的，腫瘤疫苗有一部分引起的是體內的免疫反應，雖然目前機理還不是非常清楚，但是估計跟免疫治療的機理類(lèi)似，由一點(diǎn)點(diǎn)的腫瘤疫苗來(lái)引起體內的免疫刺激反應，然后由體內的具有免疫功能的細胞來(lái)對腫瘤細胞進(jìn)行殺傷。因此，是有可能存在一種腫瘤疫苗解決大部分腫瘤的途徑的。

　　4、目前對于雙特異性抗體研發(fā)來(lái)說(shuō)，普遍性的技術(shù)問(wèn)題是什么？

　　朱建偉院長(cháng)：僅從生產(chǎn)工藝上來(lái)說(shuō)，要生產(chǎn)全雙抗的技術(shù)是非常困難的，如果沒(méi)有特殊技術(shù)參與的話(huà)，只有12.5%的正確表達率，而加上許多Nature的文章中涉及到的新技術(shù)，最多也只能提高到70%-80%，還可能產(chǎn)生其他的一些問(wèn)題。