基因編輯，尤其是CRISPR/Cas9系統，從某種意義上來(lái)說(shuō)就像是一輛正在生產(chǎn)的閃亮新車(chē)，在構建主要框架的同時(shí)也開(kāi)始啟動(dòng)，而且還準備開(kāi)始一路飚車(chē)。

　　自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因編輯之后，這個(gè)前途光明的技術(shù)已經(jīng)被應用到了許多研究領(lǐng)域，而且隨著(zhù)技術(shù)的改良，越來(lái)越多的研究團隊利用CRISPR進(jìn)行大規模的遺傳篩選，比如用于識別導致癌癥抵抗治療的突變，或者加速藥物靶標評估。RNA干擾，相比于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用，無(wú)論是效率和特異性方面，目前都難以望其項背了。

　　同時(shí)，譬如MD安德森癌癥中心等處的研究人員也開(kāi)始進(jìn)一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人類(lèi)細胞系。CRISPR/Cas9工具箱不斷的擴大，Broad研究院的張鋒等人也開(kāi)始利用Cas9結合到基因組上，停止或者加強轉錄。他們對于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用，有何看法呢？

　　張鋒研究組曾在“RationallyengineeredCas9nucleaseswithimprovedspecificity”這篇文章中，探討了從化膿性鏈球菌中改變了組成Cas9酶的1400個(gè)氨基酸中的3個(gè)氨基酸，從而將基因編輯中脫靶效應降低到了幾乎無(wú)法檢測的水平的可能性。當RNA與DNA不是那么配對的時(shí)候，Cas9內切酶會(huì )誘導脫靶突變，導致這無(wú)法成為臨床試驗中的精確基因編輯。

　　為了能容納下Cas9蛋白，DNA鏈需要分開(kāi)，張鋒研究組進(jìn)行了結構分析，發(fā)現在Cas9蛋白位點(diǎn)的負電荷非靶標DNA上有一個(gè)合適的正電荷凹槽。“我們認為如果能中和部分正電荷，就能消弱穩定性，從而能Cas9更具特異性，”張鋒說(shuō)。

　　他們利用已知定位在特殊脫靶位點(diǎn)上的導向RNAs來(lái)進(jìn)行了這個(gè)方法的實(shí)驗，研究組構建出了Cas9的32個(gè)單突變，然后將每個(gè)突變通過(guò)EMX1基因有效，但容易出現錯誤的導向RNA，靶向EMX1。

　　結果發(fā)現其中五個(gè)能完成EMX1基因的基因編輯，但是會(huì )十倍比率的減少脫靶位點(diǎn)的切割，之后研究人員又嘗試利用Cas9突變去切斷另外一個(gè)基因：VEGFA，這種基因已知能在兩個(gè)之前識別的脫靶位點(diǎn)上進(jìn)行切割。雖然所有的Cas9突變都減少了脫靶效應，但是研究人員認為他們應該結合這些突變，讓Cas9更加特異性。因此他們利用三點(diǎn)突變體（triple-pointmutations）產(chǎn)生了兩個(gè)不同的突變，發(fā)現“我們能完成靶向激活，并進(jìn)一步減少脫靶活性，”張鋒說(shuō)。

　　如何利用CRISPR發(fā)現未知基因功能

　　CRISPR系統的一大亮點(diǎn)在于導向RNAs的特異性，張鋒說(shuō)，這樣一來(lái)我們就能生成靶向每個(gè)基因或某個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)的CRISPR導向慢病毒庫。然后再轉導進(jìn)入細胞系，獲得單個(gè)基因或被激活，或被失活的細胞池。

　　2014年，2015年張鋒研究組陸續發(fā)表了相關(guān)的不少文章，如其研究組曾構建了靶向18,080個(gè)基因（64,751個(gè)獨特靶向序列）的全基因組范圍CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫慢病毒庫，用于進(jìn)行在人類(lèi)細胞中的正向和負向選擇性篩選。之后這個(gè)研究組還建立了70,290個(gè)導向RNA的文庫，來(lái)靶標人類(lèi)基因組超過(guò)兩萬(wàn)個(gè)基因，由此鑒定出了讓黑色素瘤抵抗藥物PLX-4720的基因。PLX-4720對于攜帶BRAF突變的患者療效比較好，殘存下來(lái)的癌細胞會(huì )長(cháng)成新的腫瘤，導致癌癥復發(fā)。

　　BRAFV600E是一個(gè)著(zhù)名的致癌突變，美國FDA曾批準的抗癌藥Zelboraf（vemurafenib，羅氏）就是靶向這個(gè)突變，但是隨著(zhù)細胞快速突變，一些患者在第24周治療時(shí)出現了抗性，腫瘤復發(fā)。

　　“這也許是一個(gè)機會(huì )，我們可以利用全基因組文庫檢測哪些基因在打開(kāi)或者關(guān)閉的時(shí)候，導致腫瘤細胞對vemurafenib產(chǎn)生了抗性，”張鋒說(shuō)。

　　這種CRISPR基因敲除文庫采用了能靶向基因組中所有保守編碼外顯子的導向指引，“在設計這些多條件篩選實(shí)驗的時(shí)候，我們用的都是多個(gè)導向，因此出現了一些冗余，同時(shí)也能告訴了我們，任何單個(gè)導向的效率并不是由于脫靶修飾，”他補充道。研究組也嘗試驗證了他們的這些新候選，將研究結果與之前的RNAi篩選進(jìn)行比對，結果發(fā)現能找到幾個(gè)vemurafenib抗性的tophits，而RNAi篩選只能找到一個(gè)。

　　張鋒研究組研發(fā)的功能獲得突變CRISPR篩選系統也能幫助完成了vemurafenib抗性研究，他將這個(gè)新型CRISPR激活基因篩選工具稱(chēng)為SAM，也就是協(xié)同激活調控子（synergisticactivationmediator，生物通譯），利用這一系統，其研究組激活了12個(gè)不同的基因，這些基因如果采用之前的方法很難進(jìn)行開(kāi)啟，“而且之前系統中許多基因實(shí)際上都無(wú)法真正激活，這一新系統能百倍，或者千倍的激活轉錄，”張鋒說(shuō)。

　　張鋒實(shí)驗室目前嘗試通過(guò)識別基因編輯更多有用的酶，進(jìn)一步擴增CRISPR編輯工具箱。比如去年秋天他們發(fā)現了Cpf1，這是具有不同剪切活性的DNA內切酶，能用于某些情況。新Cpf1系統也具有一些不同于Cas9的地方：

　　1.在它的自然形態(tài)下，DNA切割酶Cas9與兩條小RNAs形成了一種復合物，兩條RNAs均是獲得切割活性的必要條件。Cpf1系統更簡(jiǎn)單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標準SpCas9要小，使得它更易于傳送至細胞和組織內。

　　2.且有可能最重要的是，Cpf1以一種不同于Cas9的方式切割DNA。當Cas9復合物切割DNA時(shí)，它切割的是同一位點(diǎn)的兩條鏈，留下的“平端”（bluntends）在重新連接時(shí)往往會(huì )發(fā)生突變。采用Cpf1復合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這預計有助于精確插入，使得研究人員能夠更有效及精確地整合一段DNA。

　　3.Cpf1切口遠離識別位點(diǎn)，這意味著(zhù)即便在切割位點(diǎn)靶基因突變，仍然可以進(jìn)行再度切割，提供了多次機會(huì )來(lái)校正編輯。

　　4.Cpf1系統為選擇靶位點(diǎn)提供了新的靈活性。像Cas9一樣，Cpf1復合物必須首選附著(zhù)PAM,短序列，選擇的靶點(diǎn)靠近自然存在的PAM序列。Cpf1系統識別的PAM序列與Cas9截然不同。這在靶向某些基因組如瘧原蟲(chóng)及人類(lèi)基因組時(shí)可能是個(gè)優(yōu)勢。

　　此外，研究組還發(fā)現了其它CRISPR/Cas系統C2c1,C2c2andC2c3，目前他們正在研究其作用機制。