在一項新的研究中，來(lái)自美國萊斯大學(xué)的研究人員發(fā)現新的基因組編輯技術(shù)更為準確，而且具有更少的脫靶(off-target)錯誤。這種新技術(shù)是通過(guò)改進(jìn)現有的基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9而實(shí)現的。利用這種新技術(shù)，研究人員在自然出版集團旗下的MolecularTherapy期刊上發(fā)表了三篇論文。

　　萊斯大學(xué)生物工程教授GangBao和他的同事們的想法是讓能夠切割DNA的工程核酸酶在靶標位點(diǎn)(on-target)上的基因編輯能力最大化。盡管幾個(gè)這樣的系統---如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9---已被研究多年，但是過(guò)去三年來(lái)，利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因組編輯已吸引了全世界科學(xué)家們的目光。

　　作為細菌的一種自然發(fā)生的防御系統，CRISPR-Cas9允許研究人員設計一段短的被稱(chēng)作向導RNA(guideRNA,gRNA)的RNA序列，gRNA能夠特異性地結合到細胞中的一段DNA片段上。與gRNA組合在一起的Cas9蛋白酶然后切割這段片段，破壞它或利用模板DNA替換它。

　　這就是細菌利用CRISPR-Cas9保護自己抵抗疾病的方式。首次接觸到入侵者(如噬菌體)會(huì )導致細菌將入侵者的基因信息添加到CRISPR中。細菌然后就能識別同樣的入侵者的再次入侵，并利用合適的Cas9蛋白酶摧毀它們。

　　大約在三年前，研究人員便已發(fā)現細菌CRISPR-Cas9經(jīng)改造后能夠編輯人細胞中的DNA，比如，以細菌將入侵者的DNA特征序列錄入CRISPR中的相同方式，讓正常的或者說(shuō)野生型的序列替換突變的序列。這種技術(shù)被視為在疾病建模和治療、合成生物學(xué)和分子通路分析中具有巨大的潛力。

　　但是除了在正確的位點(diǎn)外，CRISPR-Cas9仍然會(huì )在錯誤的序列(即脫靶位點(diǎn))進(jìn)行切割。Bao說(shuō)，在治療應用上，CRISPR-Cas9的脫靶切割可能導致很多有害的后果，如癌癥產(chǎn)生。

　　Bao將CRISPR-Cas9描述為編輯基因的納米剪刀。目前，他正在研究改進(jìn)CRISPR-Cas9的方法。

　　他的目標之一就是治療遺傳性疾病鐮刀貧血癥(sicklecellanemia)。他希望利用CRISPR-Cas9最終治愈這種疾病。但是首先這種治療方法必須更好地避免在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行切割以免導致不想要的副作用。

　　在第一和第二篇論文中，研究人員研究了Cas9蛋白不同的直系同源物(ortholog)，即與CRISPR/Cas9技術(shù)經(jīng)常用到的釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes,Spy)具有相同祖先但屬于不同種屬的Cas9蛋白。

　　Bao說(shuō)，“在這兩篇論文中，我們的方法就是探索使用不同Cas9直系同源物的可能性。確實(shí)存在很多可能性。”

　　在第一篇論文中，Bao和他的團隊在哺乳動(dòng)物細胞開(kāi)展實(shí)驗來(lái)描述來(lái)自腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides,Nme)的CRISPR-Cas9系統。他說(shuō)，在生物工程師降低脫靶位點(diǎn)編輯風(fēng)險上，Nme的CRISPR-Cas9與Spy存在差別。

　　這種差別主要存在于不是靶位點(diǎn)的一部分但在靶位點(diǎn)附近的DNA序列上。這種序列被稱(chēng)作前間區序列鄰近基序(protospacer-adjacentmotif,PAM)，是靶DNA序列的一種標志物，也是Cas9蛋白結合所必需的。在Spy編輯中，PAM序列通常長(cháng)3個(gè)核苷酸。而對Nme而言，所需的PAM序列更加長(cháng)一些---8個(gè)核苷酸。根據研究人員的說(shuō)法，這意味著(zhù)Nme的CRISPR-Cas9很可能只有更少的結合位點(diǎn)，而且這些結合位點(diǎn)也很可能是正確的靶位點(diǎn)。他們聲稱(chēng)，這可能成為一種更加安全的基因編輯替代選擇。

　　在第二篇論文中，通過(guò)與來(lái)自德國弗萊堡大學(xué)的研究人員合作，研究人員利用另一種細菌的CRISPR-Cas9系統實(shí)現了高度特異性的人基因編輯。在這項研究中，SpyCas9蛋白被來(lái)自嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles,Sth)的Cas9蛋白替換，其中SthCas9也識別更長(cháng)的PAM序列。在人細胞中開(kāi)展的測試發(fā)現SthCas9蛋白具有更為嚴謹的PAM序列需求因而在避免脫靶效應上比SpyCas9表現得更好。

　　Bao和同事們也研究了能夠存在于DNA和RNA上的影響靶向切割的凸起效應。當一段序列比gRNA特異性結合的DNA序列長(cháng)或短一個(gè)核苷酸時(shí)，凸起就會(huì )出現。

　　他說(shuō)，“我們發(fā)現即便DNA或RNA形成凸出，Cas9蛋白仍然能夠切割。這是我們的研究取得的獨特貢獻。沒(méi)有人觀(guān)察這種情形，但是我們證實(shí)了這一點(diǎn)。也因此，我們開(kāi)發(fā)出一種基于網(wǎng)路的工具來(lái)尋找潛在的含有錯配堿基、RNA凸起或DNA凸起的脫靶位點(diǎn)。”

　　Bao注意到，不同于Spy，NmeCas9蛋白和SthCas9蛋白足夠小而能夠被包裝到腺相關(guān)病毒(AAV)中以便轉運到動(dòng)物的特定細胞中用于治療。他說(shuō)，“這是另一項優(yōu)勢，也是我們想繼續研究這兩種系統的原因。”

　　第三篇論文是對當前的CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行綜述，著(zhù)重關(guān)注可獲得的用于靶標選擇、實(shí)驗性方法和驗證的基因組編輯工具。Bao和他的團隊也列出仍待解決的以便消除脫靶效應的一系列挑戰。

　　他說(shuō)，他所取得的進(jìn)展部分上是由于他研究?jì)煞N新的細菌CRISPR-Cas9系統以及以下事實(shí)：在實(shí)驗室中，CRISPR-Cas9比諸如TALEN和ZFN之類(lèi)的其他基因組編輯系統更為容易執行。

　　Bao說(shuō)，不同于這些較早出現的基因組編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9更便于學(xué)生們在短時(shí)間內學(xué)習和使用。

　　Bao希望讓他的實(shí)驗室成為德州醫學(xué)中心基因組編輯的焦點(diǎn)。為此，去年12月在萊斯大學(xué)生物科學(xué)研究合作計劃(BioScienceResearchCollaborative,BMC)精心舉辦的研討會(huì )上，他將德州醫學(xué)中心基因組編輯領(lǐng)域的科學(xué)家們聚集在一起。

　　他說(shuō)，“我們進(jìn)行了大量討論。我想要推動(dòng)的一件事情就是將德州醫學(xué)中心使用CRISPR的很多實(shí)驗室之間建立一種合作關(guān)系。這些實(shí)驗室需要設計CRISPR系統用于不同的目的，但是都存在許多相同的問(wèn)題。如果我們攜手努力，那么將會(huì )更容易解決這些問(wèn)題。”