近日，中國科學(xué)家利用基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9，對抑制狗骨骼肌生長(cháng)的基因（MSTN）進(jìn)行了敲除，培育出兩只肌肉發(fā)達的“大力神”狗，成功構建了世界首個(gè)基因敲除狗模型。

　　科研人員所使用的“基因編輯技術(shù)”，顧名思義，能夠讓人類(lèi)對目標基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著(zhù)其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

　　一、與諾獎“擦肩而過(guò)”的CRISPR/Cas9技術(shù)

　　這不是CRISPR/Cas9這項明星技術(shù)第一次得到人們的關(guān)注。在此之前，有著(zhù)“豪華版”諾獎之稱(chēng)的“2015年度生命科學(xué)突破獎”頒發(fā)給了發(fā)現基因組編輯工具“CRISPR/Cas9”的兩位美女科學(xué)家——珍妮弗?杜德娜和艾曼紐?夏邦杰。二人更是獲得了2015年度化學(xué)領(lǐng)域的引文桂冠獎——素有諾獎“風(fēng)向標”之稱(chēng)，曾被認為是今年諾貝爾化學(xué)獎的最有力競爭者。

　　那CRISPR/Cas9到底是一項什么技術(shù)，為何能夠獲得如此這般青睞，又何以在短短兩三年時(shí)間內，發(fā)展成為生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的研究工具之一，并有近700篇相關(guān)論文發(fā)表？它將來(lái)又會(huì )如何影響到我們的生活？

　　CRISPR/Cas9是繼“鋅指核酸內切酶（ZFN）”、“類(lèi)轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）”之后出現的第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。與前兩代技術(shù)相比，其成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗室，成為科研、醫療等領(lǐng)域的有效工具。

　　二、CRISPR/Cas系統的靈感來(lái)源

　　CRISPR/Cas9技術(shù)的靈感來(lái)源于細菌的一種獲得性免疫系統。與哺乳動(dòng)物的二次免疫應答類(lèi)似，細菌在抵抗病毒或外源質(zhì)粒入侵時(shí)，會(huì )產(chǎn)生相應的“記憶”，來(lái)抵抗該種外源遺傳物質(zhì)的再次入侵，而這種獲得性免疫正是由細菌的CRISPR/Cas系統實(shí)現的。

　　在細菌的基因組上，存在著(zhù)串聯(lián)間隔排列的“重復序列”，這些重復序列相對保守，我們稱(chēng)之為CRISPR序列（ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats—成簇的規律間隔的短回文重復序列）。

　　1、“記錄”入侵者檔案

　　其中的“間隔序列”來(lái)源于病毒或外源質(zhì)粒的一小段DNA，是細菌對這些外來(lái)入侵者的“記錄”。（如圖A所示）。

　　病毒或外源質(zhì)粒上，存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對應。“原間隔序列”的選取并不是隨機的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個(gè)堿基往往都很保守，我們稱(chēng)為PAM（Protospaceradjacentmotifs-原間隔序列臨近基序）。

　　當病毒或外源質(zhì)粒DNA首次入侵到細菌體內時(shí)，細菌會(huì )對外源DNA潛在的PAM序列進(jìn)行掃描識別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細菌基因組上CRISPR序列中的兩個(gè)“重復序列”之間。這就是“間隔序列”產(chǎn)生的過(guò)程。

　　2、打擊二次入侵者

　　當外源質(zhì)?；虿《驹俅稳肭炙拗骶鷷r(shí)，會(huì )誘導CRISPR序列的表達。同時(shí)，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱(chēng)為Cas基因。CRISPR序列的轉錄產(chǎn)物CRISPRRNA和Cas基因的表達產(chǎn)物等一起合作，通過(guò)對PAM序列的識別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補配對，來(lái)找到外源DNA上的靶序列，并對其切割，降解外源DNA。這也就實(shí)現了對病毒或外源質(zhì)粒再次入侵的免疫應答。

　　正是基于細菌的這種后天免疫防御機制，CRISPR/Cas9技術(shù)應運而生，從而使科學(xué)家們利用RNA引導Cas9核酸酶實(shí)現對多種細胞基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾。

　　三、CRISPR/Cas9技術(shù)的實(shí)現需要什么？

　　在CRISPR/Cas9技術(shù)中，我們把即將被編輯的細胞基因組DNA看作病毒或外源DNA?；蚓庉嫷膶?shí)現只需要兩個(gè)工具——向導RNA（guideRNA，gRNA）和Cas9蛋白。

　　其中，向導RNA的設計并不是隨機的，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（即三堿基序列NGG，其中N可以是任意堿基），而且向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設計一條向導RNA（向導RNA1，向導RNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉入細胞中，向導RNA通過(guò)堿基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會(huì )使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

　　對于DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著(zhù)DNA損傷修復的應答機制，會(huì )將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，從而實(shí)現了細胞中目標基因的敲除。

　　而DNA片斷的插入或定點(diǎn)突變的實(shí)現，只需在此基礎上為細胞提供一個(gè)修復的模板質(zhì)粒，這樣細胞就會(huì )按照提供的模板在修復過(guò)程中引入片段插入或定點(diǎn)突變，對受精卵細胞進(jìn)行基因編輯，并將其導入代孕母體中，可以實(shí)現基因編輯動(dòng)物模型的構建。

　　當然，CRISPR/Cas9技術(shù)的成功率并非百分之百。向導RNA靶向序列的非特異性，以及DNA損傷修復的不確定性，都可能會(huì )導致基因組上其它位置產(chǎn)生未知的突變，也就是所謂的“脫靶”現象，這也是現階段影響CRISPR/Cas9技術(shù)應用的瓶頸之一。但隨著(zhù)科研人員不斷對Cas9蛋白的優(yōu)化改造，對靶基因識別特異性的增強，CRISPR/Cas9技術(shù)的“打靶”效率將不斷提高。

　　四、CRISPR/Cas9的前景如何？

　　CRISPR/Cas9技術(shù)在醫療健康、生產(chǎn)生活、家畜育種等領(lǐng)域的應用，不斷取得喜人的新成果。

　　如在醫療健康領(lǐng)域，用iPS細胞（誘導多能干細胞）治療人類(lèi)的鐮刀形貧血癥，可以將病人的皮膚細胞誘導成iPS細胞，利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導同源重組來(lái)修復發(fā)生突變的血紅蛋白基因，再將修復的iPS細胞定向誘導分化為造血干細胞移植到病人體內。此外，像使用CRISPR技術(shù)根除HIV病毒、誘導宮頸癌細胞自我毀滅、構建癌癥模型等最新成果先后被Nature等著(zhù)名雜志所報道。在奶制品的發(fā)酵中，利用CRISPR/Cas9增強發(fā)酵菌株對噬菌體的防御能力；在家畜育種方面，也正在利用基因編輯工具通過(guò)對顯著(zhù)影響家畜生產(chǎn)性能的基因位點(diǎn)進(jìn)行改良，以實(shí)現豬、牛、羊等大型家畜生產(chǎn)性能的提高等。

　　但正如科學(xué)是把雙刃劍，任何新技術(shù)的出現都少不了其反對者的存在，在CRISPR/Cas9技術(shù)得到熱烈呼聲的同時(shí)，不少人也對它提出了質(zhì)疑，特別是對其脫靶事件可能導致基因組其他位置產(chǎn)生未知突變表示擔憂(yōu)。

　　作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項重大突破，筆者認為CRISPR/Cas9的創(chuàng )新性、技術(shù)性毋庸置疑，隨著(zhù)對CRISPR系統認識的加深，實(shí)驗設計的優(yōu)化改造，相信其打靶效率會(huì )進(jìn)一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技術(shù)終究會(huì )帶來(lái)一場(chǎng)科學(xué)史上的巨大變革。期待在不久的將來(lái)，CRISPR/Cas9所帶來(lái)的巨大轉變必將能夠惠澤萬(wàn)家，到時(shí)候屬于它的諾獎終將到來(lái)。