系列1.生物制品中殘留DNA檢測標準的變化

　　2015年3月底，中國食品藥品檢定研究院網(wǎng)站的國家藥品標準物質(zhì)目錄中新增加了一個(gè)編號為410001的產(chǎn)品：CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（PCR-熒光探針?lè )ǎ?。這個(gè)由中檢院與中科院聯(lián)合研發(fā)，由生物制藥企業(yè)參與標定的試劑盒與現行美國藥典（USP）建議的檢測方法同步，但與2010版藥典附錄中外源性DNA殘留量測定法有所不同，可能會(huì )對國內生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)的上下游企業(yè)產(chǎn)生影響。

　　生物制品中宿主細胞殘留DNA具有潛在致瘤和傳染風(fēng)險，所以各國藥品監管部門(mén)對DNA雜質(zhì)的限量要求非常嚴格。美國藥典在GeneralChapter<1130>介紹了三種常用技術(shù)，但將在2015年頒布的新版（USP38-NF33）中增加全新章節（GeneralChapter<30>）來(lái)進(jìn)一步規范殘留DNA檢測的方法和標準物質(zhì)。與1000號以上的章節不同的是，USP編號1000以?xún)鹊恼鹿澰敿氁幎藱z測技術(shù)、系統適應性標準和標準物質(zhì)。新版USP中將唯一推薦qPCR法作為生物制品中宿主殘留DNA的標準方法。qPCR法的技術(shù)優(yōu)勢在于序列特異性高、靈敏度高、重現性好，可以為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測手段。

　　我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，很早以前開(kāi)始就對生物制品中殘余DNA含量進(jìn)行限制。從衛生部頒布的《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點(diǎn)》到近年的《中國生物制品規程》都對DNA含量做了嚴格要求，部分標準高于國際標準。2010年版中國藥典附錄收錄了DAN探針雜交法和熒光染料法，這兩種方法都存在技術(shù)缺陷，很難達到雜質(zhì)限量檢測的靈敏度，已經(jīng)被歐美藥典摒棄。目前，仍有很多國內企業(yè)沿用這兩種方法檢測殘留DNA，致使生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量很難達到國際一流水平。根據殘余DNA檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢，小編預計我國2015版藥典或增補版本中將出現qPCR方法。企業(yè)在生產(chǎn)與研發(fā)中采用中檢院標準物質(zhì)目錄中提供的成套試劑盒，可以大幅度減少費時(shí)、耗力、成本高昂的方法學(xué)考察，只需開(kāi)展少量方法適應性實(shí)驗，就可以在生產(chǎn)工藝和質(zhì)控體系的優(yōu)化方面發(fā)揮實(shí)際作用，同時(shí)滿(mǎn)足美國FDA相關(guān)標準的要求。同時(shí)，聯(lián)合研發(fā)單位中科院湖州營(yíng)養中心提供免費技術(shù)咨詢(xún)和培訓，幫助企業(yè)解決試劑盒應用中的各種技術(shù)問(wèn)題。

　　生物制品可用于治療和預防疾病，關(guān)系到患者和健康人的用藥安全，產(chǎn)品質(zhì)量必須得到保障。我國藥品監管部門(mén)對生物制品中殘留DNA的限量標準制訂的非常嚴格，但藥典修訂存在一定滯后性，附錄中的檢測技術(shù)與先進(jìn)國家尚存在差距，企業(yè)在研發(fā)和生產(chǎn)中應具有一定前瞻性，否則會(huì )使改進(jìn)工藝、提高質(zhì)量、保障安全的努力大打折扣。

　　系列2.為什么要檢測殘余DNA？

　　生物制劑是制藥行業(yè)中發(fā)展最快的領(lǐng)域，2014年全球十大暢銷(xiāo)藥中7個(gè)是生物制劑。這些銷(xiāo)售上的重磅炸彈在臨床上療效確切，但研發(fā)成本高，生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求非常嚴格。絕大部分生物制劑是不經(jīng)過(guò)胃腸道直接進(jìn)入體內，所以除了生物活性外，監管部門(mén)對藥品中雜質(zhì)的限量要求非常嚴格。其中，宿主細胞殘留DNA因為具有特別的潛在安全風(fēng)險，一直是國內外藥品監管機構關(guān)注的重點(diǎn)。美國藥典會(huì )從2011年開(kāi)始就組織專(zhuān)門(mén)小組討論修訂生物制品中殘留DNA檢測方法，并在2014年P(guān)rescription/Non-PrescriptionStakeholderForumMeeting#5上宣布將在2015年藥典修訂版中增加新的章節（GeneralChapter<30>）來(lái)規范檢測方法和標準物質(zhì)。為什么美國藥典會(huì )的專(zhuān)家組花幾年時(shí)間討論一個(gè)微量成分（<100pg/劑量）的檢測方法？還要專(zhuān)門(mén)增加章節來(lái)規范化？

　　回答這些問(wèn)題，先要了解它的來(lái)源和潛在危害性。生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續傳代的動(dòng)物細胞株表達生產(chǎn)，雖然經(jīng)過(guò)嚴格的純化工藝，但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細胞的DNA片段。這些殘余DNA可能帶來(lái)傳染性或致瘤性風(fēng)險，比如殘留DNA可能攜帶HIV病毒或Ras癌基因。分布在哺乳動(dòng)物細胞基因組的LINE-1序列可能發(fā)揮逆轉錄轉座子作用插入到染色體中，這種插入可能影響關(guān)鍵基因功能的發(fā)揮，比如激活癌基因或抑制抑癌基因。

　　此外，由于微生物來(lái)源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重組蛋白藥物在體內的免疫源性風(fēng)險。目前的研究結果顯示，殘留DNA的致瘤性相比傳染性風(fēng)險要低，但考慮到致瘤性實(shí)驗是動(dòng)物實(shí)驗，傳染性實(shí)驗是在細胞水平做的，或許對兩方面的風(fēng)險都不能掉以輕心。眾所周知，外源蛋白可能引起嚴重免疫反應，但關(guān)于殘留DNA誘導的免疫反應的研究還不多。在一些臨床前和臨床研究中報道了高劑量的核酸樣品，比如DNA疫苗或佐劑中的CpG寡聚核苷酸，可以誘導免疫反應，還誘導產(chǎn)生DNA抗體。

　　生物制品中宿主殘余DNA既是是生產(chǎn)中帶來(lái)的雜質(zhì)，還存在一定安全隱患。因此，WHO和各國藥物注冊監管機構一般只允許生物制劑中存在100pg/劑量以下的殘留DNA。根據雜質(zhì)來(lái)源和工藝，特殊情況下最高允許10ng/劑量。

　　系列3.各種殘余核酸檢測技術(shù)的優(yōu)劣

　　正如前面講過(guò)，2015年版的美國藥典將新增章節對殘余DNA檢測進(jìn)行規范化，那究竟和現有方法有什么不同？為什么最后只確定了一種方法？我們來(lái)看看現行美國藥典對于殘余DNA檢測的總體要求[GeneralChapter〈1130〉NUCLEICACID-BASEDTECHNIQUES-APPROACHESFORDETECTINGTRACENUCLEICACIDS(RESIDUALDNATESTING)]。"因為殘留DNA涉及到潛在來(lái)源（傳染性病毒DNA）、管理規程等關(guān)鍵問(wèn)題，藥品監管部門(mén)建議必須建立產(chǎn)品的DNA殘留檢測方法。不論是否成品的常規檢測包含DNA殘留含量檢測，還是工藝開(kāi)發(fā)中已經(jīng)證實(shí)了DNA清除率，殘留DNA技術(shù)指標和定量分析監測規程都必須確立。分析方法包括雜交法、基于DNA結合蛋白的免疫色譜法（閥值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA擴增方法。理想的定量檢測方法的靈敏度應該能夠檢測到約10pg/劑量的殘留DNA。雜交法、閥值法和定量PCR方法因為靈敏度可以達到檢測要求，所以屬于經(jīng)典方法。"下面我們引用美國藥典（USP）<1130>的內容分別介紹一下這三種方法。

　　雜交法（Hybridization-based）：在這種方法中，根據宿主DNA序列設計DNA探針用于測定產(chǎn)品中配對DNA的數量。雙鏈DNA被變性成單鏈后固定在尼龍膜或硝化纖維膜上，DNA探針被放射或熒光隨機摻入標記以后，與膜上固定的樣品宿主DNA雜交結合，并在膠片或成像儀對應位置中顯現斑點(diǎn)。對于熒光標記的探針，斑點(diǎn)的光密度結果可以在儀器中定量分析。斑點(diǎn)光密度對應結合在目標DNA上的探針數，進(jìn)而推測出殘留DNA的數量。通過(guò)目測方法可以半定量地檢測樣品中殘留DNA，儀器讀片可以對應斑點(diǎn)光密度繪制標準曲線(xiàn)，對應檢測結果更加準確。

　　DNA結合蛋白免疫閾值法（DNA-BINDINGPROTEIN-BASED）：這種方法使用DNA結合蛋白和DNA抗體，分四步檢測。第一步，通過(guò)加熱把DNA變性成單鏈DNA，變性后DNA與偶聯(lián)了親和素的DNA結合蛋白以及偶聯(lián)了尿素酶的DNA單克隆抗體混合反應，液相中的單鏈DNA、DNA結合蛋白、DNA抗體共同形成序列非特異的復合物。第二步，樣品混合液通過(guò)生物素標記的膜，親和素-生物素結合把DNA復合物固定在膜上，洗去非特異吸附。第三步，膜放入檢測儀器中與尿素溶液反應，反應產(chǎn)物氨改變溶液pH值并被儀器記錄變化。這種pH值的變化直接與樣品中的DNA數目相關(guān)。第四步，儀器軟件自動(dòng)分析原始數據確定樣品中殘留DNA數量。

　　定量PCR法（QUANTITATIONPCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特點(diǎn)已經(jīng)被應用于生物制藥的一些領(lǐng)域（拷貝數檢測與病毒檢測）。這項技術(shù)能夠確定各種樣品中目標DNA序列的準確數量。DNA探針的設計非常關(guān)鍵，這種DNA探針包含一端染料分子和另一端淬滅分子。當特殊設計的DNA引物引導DNA聚合酶沿著(zhù)模板序列復制合成另一條對應序列時(shí)，DNA聚合酶切斷結合在目標DNA上的探針染料端，釋放到反應液里的染料信號被儀器測量。經(jīng)過(guò)數十個(gè)循環(huán)的DNA擴增，熒光信號與起始DNA模板成對應關(guān)系，對應標準曲線(xiàn)可以準確計算出樣品中殘留DNA的數量。

　　美國藥典附錄進(jìn)一步對三種方法進(jìn)行了應用評價(jià)。雜交法可以序列特異性地檢測目標DNA，但32P標記的探針因為存在半衰期短、放射等問(wèn)題，實(shí)際應用并不廣泛。熒光標記的探針如果采用儀器讀取信號，雜交法理論上可以達到定量檢測要求的靈敏度，但是檢測時(shí)間需要48小時(shí)。閾值法因為是采用DNA抗體的非特異序列免疫檢測技術(shù)，不能特異性識別宿主殘留DNA序列，且容易受到環(huán)境和操作人員的DNA污染，導致讀值偏高。qPCR法具有序列特異性，靈敏度、準確度、精密度都好，還可以高通量篩選，但開(kāi)發(fā)一個(gè)合格的q-PCR試劑檢測宿主殘留DNA并不是件容易的事情。有人會(huì )提出疑問(wèn)，終產(chǎn)品中應該限定任何物種的DNA殘余以確保安全性，所以閾值法是不是最合理的分析方法？

　　這里還需要強調一下宿主殘余DNA檢測的目的：

　　1.確認純化工藝合理，能有效去除宿主DNA殘余；

　　2.確認產(chǎn)品中雜質(zhì)含量符合標準要求。非特異性的DNA檢測結果不能區分究竟是生產(chǎn)中污染、檢測污染、或是工藝缺陷引起的DNA殘余，就無(wú)法為解決方案提供有效信息。在嚴格的生產(chǎn)體系中，殘留DNA檢測是解決工藝合理性問(wèn)題，任何外源污染問(wèn)題都歸SOP或GMP管理體系解決。最后，經(jīng)典的殘留DNA檢測方法靈敏度不同，qPCR法、DNA結合法、雜交法的檢測限分別達到<1、

　　3、6pg/樣品的水平（目前qPCR法靈敏度可達10fg），但是技術(shù)上限制，要求待測DNA片段分別不能小于50、150、600bp才能用于雜交法、q-PCR法、閾值法檢測，而WHO和FDA可接受的DNA限度內的片段長(cháng)度<200bp。

　　由此可見(jiàn)，這三種方法中，qPCR法的適用性和技術(shù)指標最好。從qPCR技術(shù)原理來(lái)看，Taqman法要優(yōu)于熒光染料隨機摻入的SYBRGreen法。正如前面介紹的USP修訂內容，經(jīng)過(guò)幾年來(lái)對三種檢測方法的系統研究和應用反饋，美國藥典會(huì )將在新版藥典中唯一推薦qPCR法作為生物制品殘留DNA檢測的標準方法。

　　系列4.我國生物制品中殘余DNA檢測標準與技術(shù)

　　我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，很早以前開(kāi)始就對生物制品中殘余DNA的含量進(jìn)行限制。酵母、大腸桿菌表達的生物制品限定不超過(guò)10ng/劑，CHO和vero細胞表達的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過(guò)100或10pg/劑。2010年版中國藥典附錄收錄了DNA探針雜交法和熒光染料法作為殘余DNA檢測方法。以地高辛標記斑點(diǎn)雜交法為代表的DNA雜交法因為操作復雜，耗時(shí)較長(cháng)，且只能半定量，在2014年美國藥典修訂版征詢(xún)意見(jiàn)稿中（PF40(2)）中已經(jīng)被剔除。以PicoGreen為代表的熒光染料法是基于熒光染料分子直接與雙鏈DNA結合后，經(jīng)帶有熒光檢測功能的酶標儀激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號，因為不能檢出單鏈DNA，且沒(méi)有序列特異性，以及靈敏度較低（>300pg）等原因，早已被歐美藥典摒棄。

　　我國2010版藥典及2015版藥典（附錄IXB外源性DNA殘留量測定法）的征求意見(jiàn)稿中收載了的DNA探針雜交法和熒光染料法，而2009年美國USP就收錄了雜交法、閾值法和qPCR法，到2015年底USP將只收錄高靈敏度、高特異性的qPCR法作為殘留DNA檢測的推薦方法。由此可見(jiàn)qPCR法將成為國際公認的殘留DNA檢測方法，也可能會(huì )是我國下一版藥典的主要修訂內容。國內生物制品研發(fā)與生產(chǎn)企業(yè)，以及生產(chǎn)純化填料的上下游企業(yè)，盡早建立以qPCR方法為基礎的宿主殘余DNA檢測體系，將有利于改進(jìn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)現與歐美發(fā)達國家生物藥品標準的接軌。

　　系列5.國家標準物質(zhì)庫中的試劑盒技術(shù)性能

　　為了提升國內企業(yè)和監管部門(mén)對生物制品中宿主殘余DNA的檢測技術(shù)水平，實(shí)現與國際標準的接軌，中檢院聯(lián)合中科院、生產(chǎn)與研發(fā)企業(yè)開(kāi)發(fā)了首個(gè)基于qPCR技術(shù)，具有自主知識產(chǎn)權的國產(chǎn)CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒。研發(fā)中除了常規方法學(xué)研究和穩定性考察，還開(kāi)展了DNA碎片化、種屬特異性、不同的儀器通用性、抗蛋白干擾、國外同類(lèi)產(chǎn)品性能對比等研究，并在驗證試驗中考察了對國內多家生產(chǎn)企業(yè)和研發(fā)企業(yè)不同樣本基質(zhì)的適用性。由中檢院采用國家標準物質(zhì)CHO細胞DNA標定并驗證的試劑盒提供了從樣品提取、純化到PCR檢測的整套試劑，定量靈敏度達到10fg/rxn，DNA片段大于120bp，內標加樣回收率在70~130%（新版美國USP的標準將調整為50~150%），可以為CHO細胞表達的不同品種、不同劑量的生物制劑提供靈活、準確的DNA限量檢測。試劑盒具有2年保質(zhì)期，并由聯(lián)合研發(fā)單位中科院湖州營(yíng)養中心提供免費技術(shù)咨詢(xún)和操作培訓服務(wù)，幫助企業(yè)盡快掌握該技術(shù)。中檢院和中科院湖州營(yíng)養中心的聯(lián)合研發(fā)項目還將陸續推出E.coli、Yeast和vero細胞殘余DNA檢測試劑盒，為國內生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、為監管部門(mén)制訂國家標準提供技術(shù)支持。