頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分，據世界衛生組織（WHO）評估近年我國頭頸部腫瘤的年發(fā)病率為每10萬(wàn)人中15.22人次（15.22/10萬(wàn)），占全身惡性腫瘤的4.45%。早期無(wú)明顯臨床癥狀，目前其治療方案是以手術(shù)治療為輔，放療化療為主。芝加哥大學(xué)醫學(xué)院的報道顯示即使行手術(shù)或局部放化療，其遠端轉移轉移率仍高達4-23%，且往往提示著(zhù)不良的預后【1,2】。由于臨床確診的頭頸部腫瘤主要為進(jìn)展期，從而失去了最佳治療的時(shí)機，而頭頸部腫瘤的臨床常見(jiàn)致殘、致死的主要原因為腫瘤的復發(fā)和轉移。外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulatingtumorcells,CTCs)被認為與惡性腫瘤的復發(fā)、轉移密切相關(guān)，因其對腫瘤的早期診斷、臨床分期、復發(fā)轉移和耐藥監測、預后判斷、開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。美晶醫療與臨床合作代表就目前CTCs檢測技術(shù)在腫瘤輔助診療和預后的意義進(jìn)行歸納總結，以期為今后腫瘤的復發(fā)轉移和耐藥監測、預后判斷，治療策略的及時(shí)調整，開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供新的思路和重要依據。
頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分。比較常見(jiàn)的是：甲狀腺腫瘤，喉癌、副鼻竇癌及各種口腔癌（如舌癌、牙齦癌、頰癌等，見(jiàn)圖1）。
圖1：頭頸部淋巴結與組織示意圖（源自中國醫學(xué)科學(xué)院腫瘤醫院頭頸部腫瘤放射治療圖譜）
因此，頭頸部腫瘤的原發(fā)部位與病理類(lèi)型居全身腫瘤之首。同時(shí)，頭頸部重要器官比較集中，解剖關(guān)系復雜，治療方法各異。
據WHO評估，我國近年頭頸部腫瘤的年發(fā)病率為每10萬(wàn)人中15.22人次（15.22/10萬(wàn)），占全身惡性腫瘤的4.45%。按部位，頭頸腫瘤的發(fā)病依次為喉(32.1%)、甲狀腺(19.6%)、口腔(16.1%)、鼻咽(14.9%)、鼻腔副鼻竇(6.6%)、大涎腺(4.2%)、口腔(3.3%)、眼(1.52%)、下咽(1.5%)。在性別上，除甲狀腺腫瘤女性(14.2%)明顯多于男性(5.40%)外（見(jiàn)圖2），其余以男性居多。
頭頸部腫瘤病灶部位和頻率統計
其病因尚未查清，有人認為與
遺傳因素有關(guān)；長(cháng)期接觸有害的化學(xué)氣體及吸煙，亦為誘發(fā)因素之一。
什么是循環(huán)腫瘤細胞
循環(huán)腫瘤細胞（circulatingtumorcells，CTCs）是指從原發(fā)性實(shí)體瘤或轉移灶釋放，突破血管從而進(jìn)入外周循環(huán)血的腫瘤細胞。
由于CTCs的稀有性，抗原異質(zhì)性而難以富集/捕獲，研究者早期主要致力于CTCs的富集與捕獲。
目前CTCs已成為多種類(lèi)型癌癥，如乳腺癌，肺癌，前列腺癌和結腸直腸癌對于良、惡性腫瘤的鑒別有一定的提示價(jià)值。
美晶醫療與寧波市第二醫院放化療科，李惠利東部醫院及寧波七院胃腸外科的臨床合作中對不能手術(shù)或不愿手術(shù)的局部進(jìn)展期胃癌患者進(jìn)行同步放化療,并觀(guān)察療效和不良反應,取得了較好的效果，發(fā)現CTCs在胃癌的預后評估及個(gè)體化治療，療效監控等方面具有重要的臨床意義。但CTC在頭頸部腫瘤中的研究相對較少。
本文主要從CTCs的特性、檢測手段及其在頭頸部腫瘤中的應用進(jìn)行概述。
1．循環(huán)腫瘤細胞的特性與檢測手段
自1869年Ashworth首次報道外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulatingtumorcell,CTCs)的發(fā)現以來(lái)，關(guān)于CTCs的出現是”腫瘤轉移擴散“還是僅為原發(fā)病灶脫離的”單純腫瘤細胞“的問(wèn)題已經(jīng)討論了近半個(gè)世紀之久。
在過(guò)去的10數年，伴隨著(zhù)分子病理學(xué)，免疫細胞組化等高敏技術(shù)的誕生，又重新燃起了CTCs臨床意義的研究熱潮。1996年Abati【3】等提出盡管外周血中僅有非常少的一部分CTC能存活下來(lái)并形成轉移灶，但是CTC的存在就可能為轉移額發(fā)生提供了基礎，且近年的許多研究證實(shí)CTC的出現與患者的預后呈正向相關(guān)，美國德州大學(xué)MDAdeson病院的Christfani等數個(gè)研究團隊證明，乳腺癌，結直腸癌患者CTC輔助臨床診斷可以作為一個(gè)獨立的預后指標。
腫瘤細胞從原發(fā)灶生長(cháng)至發(fā)生轉移與其他惡性腫瘤往往經(jīng)歷原發(fā)灶的原位生長(cháng)（原位癌）、突破基底膜成為浸潤癌、腫瘤細胞突破血管內皮細胞從而進(jìn)入血液循環(huán)、隨血液在全身播散的腫瘤細胞滯留于遠處器官的毛細血管、在轉移灶的定植和生長(cháng)等惡性行為。
在這一過(guò)程中，CTCs被認為與惡性腫瘤的復發(fā)、轉移密切相關(guān)，因其對腫瘤的早期診斷、臨床分期、復發(fā)轉移和耐藥監測、預后判斷、開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。
2012年德國海德堡大學(xué)普外科臟器與移植專(zhuān)業(yè)的Steiner團隊在LangenbecksArchSurg上發(fā)表的研究指出【4】，每克原發(fā)腫瘤灶或轉移灶每天約有106個(gè)CTC脫落進(jìn)入外周血循環(huán)，而90%的CTC因為人體的免疫調節系統和自身凋亡而失去活力，且CTC在外周血細胞中陽(yáng)性率較低，與正常血細胞的比值約千萬(wàn)分之一到億分之一之間。
目前CTCs檢測技術(shù)主要分為物理學(xué)模式（如以細胞大小差異和過(guò)濾為基礎的方法等），正向/負向篩選模式或借助微流控芯片（CTC-Chip）。
作為中國自主研發(fā)的自動(dòng)化循環(huán)腫瘤細胞檢測系統，美晶醫療CellRichTM循環(huán)腫瘤細胞檢測系統采用免疫納米磁顆粒并結合先進(jìn)的微流體芯片設計專(zhuān)利技術(shù)對微量細胞進(jìn)行捕獲和分析，是一種先進(jìn)的循環(huán)腫瘤細胞檢測與分析平臺。該平臺具備正負向細胞篩選模式：在正向篩選模式中，通過(guò)將循環(huán)腫瘤細胞上的特異抗原與納米磁顆粒上的特異性抗體相結合，借助微流控專(zhuān)利技術(shù)使得含有腫瘤細胞的生物樣本通過(guò)梯度磁場(chǎng)，從而將循環(huán)腫瘤細胞從血液或其他背景液中篩選出來(lái)。
在負向篩選模式中，通過(guò)對生物體液樣本進(jìn)行紅細胞裂解處理，配合使用與白細胞、紅細胞或血小板等特異性結合的免疫微珠等技術(shù)手段將循環(huán)腫瘤細胞之外的細胞進(jìn)行去除，從而消除背景干擾對循環(huán)腫瘤細胞進(jìn)行檢測的技術(shù)手段。而此檢測技術(shù)開(kāi)發(fā)完成后，將與現有循環(huán)腫瘤細胞檢測系統形成良好的互補和完善。更多細節詳見(jiàn)美晶醫療轉化醫學(xué)網(wǎng)4月刊的基于微芯片的自動(dòng)化循環(huán)腫瘤細胞檢測系統?CellRichTM新型液體活檢平臺。
其臨床檢測模式以iFISH（原位熒光雜交），免疫熒光及PCR法應用較多，常見(jiàn)的有細胞角蛋白CK19；CK20；癌胚抗原（CEA）；Suivivin；Stanniocaclcin2；MicroRNA-21；各類(lèi)人類(lèi)染色體組（如CEP7,CEP8）等。目前，其在臨床應用中最大的限制就是，缺乏特別明確的特異性標志物，以上問(wèn)題導致當前CTC的研究停滯在原始階段，對CTC的單細胞特性、分子標記物的種類(lèi)及性質(zhì)的理解均不充分，距離臨床腫瘤病癥診療的轉化應用仍然有距離。
2．循環(huán)腫瘤細胞在頭頸部腫瘤中的應用
頭頸部腫瘤與其它腫瘤（如乳腺癌，前列腺癌或結直腸癌）相比，過(guò)去一直認為其預后主要取決于局部復發(fā)和區域性的淋巴轉移，其遠處轉移的發(fā)生率僅在1%左右，因此關(guān)于CTC的臨床研究相對較少。
然而伴隨著(zhù)ICC（免疫熒光檢測），iFISH,PCR等高敏感，高特異性檢測技術(shù)的發(fā)現與應用，又重新激起了對CTC臨床意義的研究興趣。近年許多研究證明CTC的出現不僅與患者的預后相關(guān)，還與腫瘤的組織學(xué)分級，腫瘤大小和淋巴結轉移情況包括有無(wú)遠處轉移相關(guān)聯(lián)。
Wollenbergtm，Funke，Pajonk【6】等團隊發(fā)表的多篇回顧性文獻對于頭頸部腫瘤遠處轉移的共識是：1）20世紀90年代，Berget等采用傳統的酶免檢測（例如堿性磷酸酶（AP）；C26或EMA單抗的免疫熒光檢測（IF）；生物素-鏈酶親和素架橋的辣根過(guò)氧化物酶（AB-PCX)模式；生物素-鏈酶親和素架橋的堿性磷酸酶（AB-AP）模式等）幾乎很難檢測到目標的CTCs（表1：酶免檢測在CTCs中的應用（引用自：FunkeIandSchrautW.JClinOncol.1998Feb;16(2):557-66.）；2）伴隨著(zhù)分子病理學(xué)，免疫細胞組化等高敏技術(shù)的誕生，外周血模擬試驗中質(zhì)控細胞的捕獲率已可達到95%及以上（圖3：質(zhì)控細胞捕獲效率）；3）頭頸部腫瘤是一種全身性疾病，患者的遠處轉移往往發(fā)生在腫瘤分級的中后期，而且預示著(zhù)不良的預后。
因此認為遠處轉移的早期診斷對頭頸部腫瘤的預后至關(guān)重要，且遠處轉利的高發(fā)生率與更短的生存期（OS)明顯相關(guān)（圖4：CTCs與預后的關(guān)聯(lián)：引用自：PLoSOne.2014Aug8）
近期寧波第七人民醫院副院長(cháng)兼外三科主任郝敬鐸醫師近日在寧波市惠民計劃的贊助下，運用美晶醫療的CellRichTM新型液體活檢平臺對轉移性腫瘤（入組數十例結直腸癌，前列腺癌，乳腺癌及頭頸部腫瘤）患者實(shí)施CTCs檢測時(shí)發(fā)現，在早期腫瘤患者中，利用影像學(xué)還未發(fā)現病灶時(shí)已經(jīng)可以在外周血中檢測到CTCs。
研究表明，在疾病的早期，外周血循環(huán)腫瘤細胞對于良、惡性腫瘤的鑒別有一定的提示價(jià)值，也有助于轉移風(fēng)險的預測和判斷；在疾病進(jìn)展和治療過(guò)程中，外周血循環(huán)腫瘤細胞能為動(dòng)態(tài)檢測病情、耐藥性等臨床診療的關(guān)鍵因素提供重要信息，有助于醫師開(kāi)展個(gè)性化的腫瘤治療。
3．循環(huán)腫瘤細胞在頭頸部鱗狀細胞癌中的應用
頭頸部鱗狀細胞癌（headandnecksquamouscellcarcinoma:SCCHN)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占頭頸惡性腫瘤的90%，占全身惡性腫瘤的10%。
WHO統計，全球每年新增病例約65萬(wàn)例，治療方式從單一手術(shù)轉變?yōu)槭中g(shù)，放化療，分子靶向治療等多學(xué)科聯(lián)合模式，任然有50-60%的患者出現原位復發(fā)，區域淋巴結轉移，約有20%的患者發(fā)現遠處轉移，其5年生存率在50%左右，且近幾十年來(lái)沒(méi)有顯著(zhù)提高。因此CTCs做為可評估HNSCC的早期檢測及預后的檢測指標，而備受關(guān)注【7,8】。
2010年美國俄亥俄州國立兒童醫院頭頸部腫瘤外科Jatana團隊【9】對48例HNSCC術(shù)后患者的血液樣本進(jìn)行CTCs計數分析，隨訪(fǎng)19個(gè)月后發(fā)現沒(méi)有檢測出CTCs的患者無(wú)病生存率明顯高于檢測出CTCs的患者，兩組之間差異有統計學(xué)意義（P=0.01）。
CTCs與患者年齡、性別、腫瘤位置（口腔、口咽、喉咽、喉）、腫瘤分期、是否加輔助治療均無(wú)相關(guān)性，認為CTCs可以做為HNSCC預后不良的獨立危險因素。
其后意大利巴倫西亞大學(xué)腫瘤醫學(xué)科的Grisanti研究組在2014年發(fā)現，當CTCs數量》2個(gè)時(shí)，HNSCC患者的預后比CTCs數量為0-1個(gè)的患者更差，患者的疾病無(wú)進(jìn)展生存率與總生存率也更差。經(jīng)過(guò)治療后8%的CTCs陽(yáng)性患者得到了控制（見(jiàn)圖5：化療前后CTCs數量變化與預后關(guān)聯(lián)）。該實(shí)驗結果刊登在2014年注明期刊PosOne【10】。
圖5：化療前后CTCs數量變化與預后關(guān)聯(lián)（引用自PLoSOne.2014Aug8;9(8)）
入組的1位頭頸部鱗狀細胞癌患者，化療前基線(xiàn)CTCs數量是3個(gè)CTCs，連續4個(gè)療程的化療后，CTCs數量上升到9個(gè)，同期實(shí)施的PET-CT所見(jiàn)顯示，在左腋下與
脊髓部陰影明顯增加，預示腫瘤進(jìn)展未得到控制。調整化療方案僅一個(gè)療程，CTCs數量從9個(gè)下降到5個(gè)，充分說(shuō)明了CTCs即可以作為判斷HNSCC預后的指標，又可以預測治療效果。（圖6）
圖6：CTCs的數量變化與影像學(xué)所見(jiàn)的聯(lián)合診斷，為修正患者治療方案提供參考意見(jiàn)（引用自PLoSOne.2014Aug8;9(8):e103918）
Bozec等【11】利用Cellsearch系統對49例Ⅲ／Ⅳ期ＨＮＳＣＣ患者進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現，治療前CTCs的檢出率為16%（8/49），NO患者的檢出率5%（1/19），N1-2C檢出率為23%（7/30），但腫瘤分級之間差異無(wú)統計學(xué)意義（P=0.012）。治療（單純手術(shù)或術(shù)后聯(lián)合放化療）６個(gè)月后，13例出現復發(fā)或轉移，在這13例患者中有2例治療前檢出了CTCs，統計結果提示治療前與治療后復發(fā)、轉移和CTCs的檢出沒(méi)有關(guān)系，同時(shí)研究還發(fā)現CTCs不但與患者的性別、是否有煙酒嗜好、腫瘤位置、腫瘤大小等無(wú)關(guān)，還與腫瘤的分化程度、腫瘤的分期均無(wú)關(guān)。但是CTCs數量的多少與患者預后及PFS，OS相關(guān)。
4.結語(yǔ)
綜上所述,基于外周血CTC檢測的對于頭頸部腫瘤臨床輔助診斷具有重要的臨床意義，其應用前景廣闊，已成為當前腫瘤臨床診療的研究熱點(diǎn)。
CTC的富集模式主要有負向，正向，膜過(guò)濾與尺寸分離等模式，檢測診斷的主要方法是ICC，iFISH和PCR等。
目前CTCs檢測的敏感性與特異性對于在其臨床應用推廣是主要考慮因素，因此進(jìn)一步提高CTCs檢測的敏感性，集成正負向等多種富集技術(shù)和高特異性生物標志物檢測是下一代液體活檢技術(shù)的主要特征。
通過(guò)連續觀(guān)察CTcs數量的變化情況和下游分析，為監測腫瘤動(dòng)態(tài)，早期發(fā)現/診斷腫瘤的復發(fā)轉移，評估治療效果或調整治療方案，為個(gè)體化治療提供全面，實(shí)時(shí)的信息和新的診療思路。
寧波美晶醫療的CTC技術(shù)平臺的現狀及展望
國外的CTC檢測公司大部分都有自己獨立研發(fā)的檢測平臺或儀器，例如：Cynveniu公司的ClearID微流體平臺，FluxionBiosciences公司的基于微流體技術(shù)以及免疫磁珠的IsoFlux系統；寧波美晶醫療技術(shù)有限公司擁有一支經(jīng)驗豐富、創(chuàng )新能力強的研發(fā)、生產(chǎn)管理和市場(chǎng)推廣的人才隊伍。公司主要開(kāi)發(fā)“精準醫療”產(chǎn)品并提供相關(guān)服務(wù)。具體產(chǎn)品包括：：
醫療器械方面
自主研發(fā)的“CellRich?”循環(huán)腫瘤細胞（CirculatingTumorCells,CTC）檢測系統及配套試劑，用于檢測血液中的循環(huán)腫瘤細胞，進(jìn)行診斷和監控癌癥病情發(fā)展。該系統已有8項發(fā)明專(zhuān)利獲得授權，20多項實(shí)用新型和軟件著(zhù)作權授權。項目填補了國內在CTC檢測儀器方面的空白，獲得了2014年“國家重點(diǎn)新產(chǎn)品”稱(chēng)號。作為同類(lèi)別中的首創(chuàng )產(chǎn)品，美晶醫療也牽頭制定了相關(guān)醫療器械分類(lèi)標準（分類(lèi)編碼6841）。目前“CellRich?”系統已經(jīng)在包括美國達特茅斯醫學(xué)院及上海胸科醫院在內的國內外多家知
名醫院投入使用。
檢驗服務(wù)方面
滿(mǎn)足“精準醫療”對基因檢測的需求，設立了美晶醫學(xué)檢驗所，已獲得衛生部頒發(fā)的醫療機構執業(yè)許可證書(shū)和臨床PCR實(shí)驗室資質(zhì)。目前美晶醫學(xué)檢驗所已開(kāi)展臨床細胞分子遺傳學(xué)等檢驗服務(wù)，包括個(gè)性化用藥基因檢測，循環(huán)腫瘤細胞檢測，疾病風(fēng)險基因檢測等多項業(yè)務(wù)。業(yè)務(wù)范圍覆蓋華東，華南地區，已在上海，杭州等地設立了區域營(yíng)銷(xiāo)中心。
液體活檢與醫學(xué)影像學(xué)診斷互補融合對于腫瘤精準診療具有重要臨床意義，隨著(zhù)液體活檢技術(shù)的不斷成熟，快速精確篩選和分析血液中完整的循環(huán)腫瘤細胞，由腫瘤細胞釋放出的外泌體，和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）等生物標記物，并與下游基因診斷相結合，將有力推動(dòng)先進(jìn)的分子診斷技術(shù)在個(gè)性化醫療中的應用。
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