近幾年來(lái)，針對CTLA-4、PD-1和PD-L1的單抗藥物在免疫治療中的效果逐漸獲得認可，癌癥免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)（ImmuneCheckpoint）概念也越來(lái)越深入人心。2018年2月22日，著(zhù)名期刊CellResearch在線(xiàn)發(fā)表了來(lái)自美國馬里蘭大學(xué)醫學(xué)院劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的最新研究成果。
近幾年來(lái)，針對CTLA-4、PD-1和PD-L1的單抗藥物在免疫治療中的效果逐漸獲得認可，癌癥免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)（ImmuneCheckpoint）概念也越來(lái)越深入人心。2018年2月22日，著(zhù)名期刊CellResearch在線(xiàn)發(fā)表了來(lái)自美國馬里蘭大學(xué)醫學(xué)院劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的最新研究成果。
研究表明，長(cháng)久以來(lái)流行的抗CTLA-4抗體Ipilimumab在癌癥免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)假說(shuō)
并不成立。
即Ipilimumab并沒(méi)有通過(guò)阻斷CTLA-4/B7相互作用而發(fā)揮抗腫瘤效果，而清除腫瘤局部高表達CTLA-4的調節性T細胞（Treg）在有效的免疫治療中至關(guān)重要。此項研究成果有助于研發(fā)新一代高效的抗CTLA-4抗體以及其它以CTLA-4為靶點(diǎn)的
抗癌藥物。
CTLA-4分子高表達于調節性T淋巴細胞（Treg）和激活的T淋巴細胞上。正常情況下，T淋巴細胞的活化需要兩條信號通路共同激活（圖1），其一是T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞（APC）呈遞的MHC-抗原肽復合物相結合（信號1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）與T細胞表面的共刺激分子CD28相結合（信號2）。
T細胞活化后高表達的CTLA-4分子雖然與CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子與B7分子結合后抑制T細胞的活化。
2011年，美國FDA批準首款抗CTLA-4抗體抑制劑Ipilimumab（商品名YERVOY?）用于
黑色素瘤的治療，其療效顯著(zhù)。根據免疫檢查點(diǎn)阻斷的假說(shuō)（CheckpointBlockadeHypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗體如Ipilimumab是主要通過(guò)阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路（圖1），從而促進(jìn)T細胞的激活而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而這一流行的關(guān)于Ipilimumab在癌癥免疫治療中發(fā)揮作用的主要假說(shuō)并沒(méi)有得到嚴格的實(shí)驗驗證。
雖然Ipilimumab可以阻斷錨定狀態(tài)的CTLA-4分子和游離的B7分子的相互作用（圖2A），但B7分子是膜表面表達的共刺激分子，因此以前的研究并不能證實(shí)Ipilimumab能夠有效阻斷在生理狀態(tài)下的CTLA-4和B7的相互作用。劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的研究表明，當B7分子被固定后（比如B7包被在ELISA板上時(shí)[圖2B]或者表達在細胞表面時(shí)[圖2C]），Ipilimumab在體外并不能很好地阻斷細胞表面的CTLA-4/B7的相互作用（圖2D），也不能有效地阻斷CTLA-4介導的B7分子的轉胞吞（Transendocytosis）作用（圖2E）。
與此不同的是，劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室篩選出的另外一種抗CTLA-4的抗體L3D10，卻能非常顯著(zhù)地阻斷各種形式的CTLA-4/B7的體外相互作用（圖2）。此外，在humanCTLA-4knock-in的人源化小鼠和humanCD34+stemcells重組的NSG小鼠中，L3D10而不是Ipilimumab，能夠顯著(zhù)抑制humanCTLA-4對脾臟樹(shù)突狀細胞表面B7分子的轉胞吞下調（圖2F），從而提供了在體內實(shí)驗中的生理狀態(tài)下Ipilimumab不能有效阻斷CTLA-4/B7相互作用的證據。
更重要的是，劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的研究指出，阻斷CTLA-4/B7的相互作用，并沒(méi)有貢獻于抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果。這一論斷來(lái)自多個(gè)方面的實(shí)驗證據：
（1）在humanCTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的兩個(gè)等位基因均來(lái)自human）的小鼠模型中，抗humanCTLA-4的抗體L3D10能夠有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用；而在humanCTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的兩個(gè)等位基因一個(gè)來(lái)自human，一個(gè)來(lái)自mouse）的小鼠模型中，只能識別humanCTLA-4的L3D10不能有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用。盡管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38腫瘤和減緩B16腫瘤的生長(cháng)。
（2）將半人源化的L3D10進(jìn)行完全人源化后篩選得到的兩株失去阻斷CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗體，并沒(méi)有影響其抗腫瘤的作用，因為HL12和HL32展現出與Ipilimumab一樣的抗腫瘤效果。
（3）用B7分子的阻斷性抗體1G10/GL1處理實(shí)驗小鼠，在事先阻斷B7功能的情況下，Ipilimumab仍能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，進(jìn)一步說(shuō)明其并不依賴(lài)于阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路。
深入研究表明，所有能有效抗腫瘤的抗CTLA-4抗體，包括強阻斷能力的L3D10和非常弱阻斷能力的Ipilimumab/HL12/HL32，都能夠有效的清除腫瘤局部的Treg。而用Fc受體的阻斷抗體2.4G2同時(shí)處理小鼠來(lái)消除抗體介導的細胞殺傷作用和抗體介導的細胞吞噬作用，則能顯著(zhù)逆轉Ipilimumab的抗腫瘤效果。
因此，劉陽(yáng)/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗室的研究表明，抗CTLA-4抗體發(fā)揮治療腫瘤功效的主要分子機制是通過(guò)清除腫瘤局部的Treg，而不是通過(guò)阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。這項研究有力地駁斥了當前流行的在癌癥免疫治療中針對CTLA-4分子的免疫檢查點(diǎn)的理論假說(shuō)。
本研究完成于作者先前所在的美國國立兒童醫學(xué)中心的癌癥與免疫學(xué)研究中心。作為論文的共同第一作者，杜雪相博士和唐飛博士在劉陽(yáng)教授和鄭盼教授的共同指導下完成了此課題的主要內容，劉明月博士貢獻了部分數據。美國OncoImmune,Inc公司、美國Immutics,Inc公司以及中國Alphamab,Inc公司提供了抗體等實(shí)驗試劑和Biacore等技術(shù)支持。本研究得到來(lái)自美國國立衛生研究院和OncoImmune,Inc公司的基金資助。
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