液態(tài)活檢技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)便發(fā)展十分迅速，針對CTC、ctDNA和外泌體的分離、捕獲、富集、純化已經(jīng)開(kāi)發(fā)出諸如免疫法、磁分選法、膜過(guò)濾法、ddPCR法、差速離心法等，而關(guān)于其鑒定、分析也涌現了許多前沿技術(shù)，正是這些技術(shù)的不斷涌現推動(dòng)了液態(tài)活檢一步步進(jìn)入臨床實(shí)踐。雖然液態(tài)活檢技術(shù)已經(jīng)取得了長(cháng)足進(jìn)展，但科研工作者對于其持續的優(yōu)化卻一點(diǎn)也沒(méi)有停止，從目前對液態(tài)活檢技術(shù)研發(fā)的趨勢來(lái)看，人們越來(lái)越傾向于研發(fā)自動(dòng)化、微型化和高通量化的儀器，因為傳統的手工操作方法存在步驟繁多、耗時(shí)長(cháng)久、人為誤差較大等問(wèn)題，既不利于臨床樣本的大批量檢測也難以確立穩定的富集效率和鑒別標準。所以，在現有技術(shù)的基礎上充分地聯(lián)合其他檢測方法，在不增加整個(gè)檢測過(guò)程的復雜程度的同時(shí)實(shí)現多模式的綜合檢測，以完成高效、準確、廉價(jià)的檢測應是未來(lái)的開(kāi)發(fā)研究重點(diǎn)。

 

　　目前關(guān)于CTC的檢測已經(jīng)出現了微流控技術(shù)、納米技術(shù)和單細胞測序技術(shù)，這些技術(shù)的出現在一定程度上加速了CTC檢測的自動(dòng)化進(jìn)程。尤其以微流控和納米技術(shù)為代表，其精準的控制性能、高效的檢測效率和簡(jiǎn)單便捷的操作優(yōu)勢已經(jīng)助力其在生物醫學(xué)領(lǐng)域大放光彩。目前很多自動(dòng)化的檢測平臺均采用了該技術(shù)，下面分別介紹其各自的特性以及發(fā)展現狀。

 

　　微流控技術(shù)

 

　　通常微流控指的是使用微管道處理微小流體的系統所涉及的科學(xué)和技術(shù)，是一門(mén)涉及化學(xué)、流體物理、微電子、新材料、生物學(xué)和生物醫學(xué)工程的新興交叉學(xué)科。由于其具有微型化、集成化等特征，故微流控裝置通常又被稱(chēng)為微流控芯片。微流控被認為在生物醫學(xué)研究中具有巨大的發(fā)展潛力和廣泛的應用前景。目前的CTC芯片分選原理可以大概歸納為被動(dòng)分選與主動(dòng)分選兩大類(lèi)。不同種類(lèi)的細胞在尺寸、密度、形狀、可變形性及親和性等物理、生物特性上各不相同，依據這些不同的特性，被動(dòng)分選技術(shù)通過(guò)流道內的微結構或微流體對細胞施加作用，從而實(shí)現分離，一般具有通量高、不需要額外施加作用力場(chǎng)的優(yōu)點(diǎn)。這些分離方法主要包括微結構過(guò)濾、場(chǎng)流及水力分選、確定性側向偏移、慣性分選、仿生分選及親和性分選等幾類(lèi)。主動(dòng)分選技術(shù)通過(guò)外力場(chǎng)對樣品流中的細胞施加作用力，從而致使其分離，其分選精度往往高于被動(dòng)分選技術(shù)。這些分選方法主要包括介電泳分選、磁分選、聲分選、光分選等幾類(lèi)。鑒于目前微流控技術(shù)還存在分選純度不高、通量偏低等問(wèn)題，尤其是面向外周血中含量極低的CTCs的分選，難以同時(shí)滿(mǎn)足高通量、高純度的分選要求。因此，研究人員多采取將被動(dòng)分選技術(shù)和主動(dòng)分選技術(shù)相結合的多級分選芯片以達到對稀有細胞的分選要求。

 

　　被稱(chēng)為第二代CTC捕獲技術(shù)的微流控CTC芯片技術(shù)（CTC-Chip）展示出了其用于分離檢測CTC的極大潛力。CTC芯片是一張與標準載玻片尺寸相同的硅片作為固相支持物，上面排列了多個(gè)蝕刻特殊排列微單元。該方法非常靈活，可以與不同的CTC分選策略相結合，如各種不同的抗體都可以包被在固相支持物上，大大提高了敏感性和從全血中捕獲稀少細胞的得率，同時(shí)操作過(guò)程相對簡(jiǎn)單溫和，從而使分離到的CTC保持一定的活力。雖然目前的微流控CTC芯片在設計、加工工藝上更復雜些，但其良好的分選效果、輕巧的體積、較少的進(jìn)樣體積、較高的靈敏度和即用即棄的便捷特性正吸引越來(lái)越多的目光，是未來(lái)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個(gè)主要方向。

 

　　但是微流控芯片技術(shù)應用于稀有細胞分選仍然存在一定的不足，比如目前已經(jīng)研究發(fā)現CTC存在16種亞型，為達到較高的捕獲效率需要固定對應的抗體，而有些抗體尚未實(shí)現商品化或者CTC不表達相應的抗原就會(huì )造成漏檢；現階段微流控平臺仍依賴(lài)于特異性的免疫識別，還無(wú)法做到對CTC全亞型和CTM以及被白細胞包裹的CTC的捕獲，從外周血液中獲取極少的CTC仍存在較大的困難，并且需要耗費一定的時(shí)長(cháng)以保障其能發(fā)生較為充分的免疫反應，即便是基于抗原抗體吸附的方法仍不能完全避免CTC丟失的情況；而且微通道中微結構的擠壓，高剪切流的流場(chǎng)，外加的電場(chǎng)都會(huì )對細胞的活性造成一定程度的損傷，對后續的分離培養造成困擾。

 

　　納米技術(shù)

 

　　近年來(lái)納米技術(shù)的飛速發(fā)展，已被成功應用到許多領(lǐng)域，包括醫學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)等。納米顆粒具有獨特的光學(xué)、電學(xué)、化學(xué)、機械和物理性質(zhì)，這在解決醫學(xué)檢測方面的難題上起到了巨大的促進(jìn)作用。納米材料根據材質(zhì)和形狀不同可分為很多種，如金納米顆粒、磁納米顆粒、碳納米管、納米孔和微懸臂等。隨著(zhù)納米技術(shù)的發(fā)展，人們可獲得結構可控、表面功能化的不同種納米材料，納米材料所表現出的小尺寸效應、高比表面積等諸多不同于一般材料的特性，使血液中極少量的CTC的捕獲成為可能。納米材料與納米結構與CTC的高接觸幾率，也可以大大提高CTC的富集效率被廣泛用于CTC的富集和檢測。納奧生物基于第三代非抗體依賴(lài)的捕獲技術(shù)開(kāi)發(fā)的Nextctc循環(huán)腫瘤活細胞捕獲儀即是結合了國際領(lǐng)先的納米技術(shù)和微流控技術(shù)，率先在國內實(shí)現了非抗體依賴(lài)的CTC活性單細胞無(wú)損捕獲，利用納米技術(shù)捕獲分離的CTC細胞保存了原始的活力，完全可以用于后續的藥敏試驗和全基因型測序，而且還可以最大限度地捕獲上皮來(lái)源、間質(zhì)來(lái)源以及干細胞來(lái)源所有表型循環(huán)腫瘤細胞，最大程度地降低了因為發(fā)生EMT過(guò)程或形成CTM以及被其他細胞包裹所造成的漏檢。鑒于納米材料的諸多優(yōu)點(diǎn)，將納米顆粒應用到CTC的檢測中具有非常巨大的潛力。

 

　　單細胞測序技術(shù)

 

　　單細胞全基因測序技術(shù)及單細胞基因組學(xué)的發(fā)展，某種程度上解決血液CTCs數量稀少的難題，不需要獲得大量的CTC即可進(jìn)行基因組學(xué)的分析，能檢測更多藥效相關(guān)基因及分析耐藥機制，為CTCs的分子分型及靶向藥物治療提供更準確的信息?；蚧蚧蚪M變異是腫瘤發(fā)生的根本原因，利用單細胞全基因組測序技術(shù)，可以更精準地獲取腫瘤細胞并深入分析，發(fā)現正常細胞與腫瘤細胞差異，了解癌細胞的基因突變，鑒別腫瘤的來(lái)源、分析腫瘤生長(cháng)規律，為早期診斷腫瘤和開(kāi)展腫瘤個(gè)體化治療提供指導。此外，腫瘤的異質(zhì)性是導致腫瘤耐藥的原因之一。從單個(gè)腫瘤細胞水平對腫瘤單細胞進(jìn)行測序，找出一個(gè)腫瘤在單個(gè)細胞上的共同結構，揭露每個(gè)腫瘤細胞的突變規律，為抗癌藥物研究、腫瘤靶向治療提供基礎。

 

　　總結與展望

 

　　目前，尚存在循環(huán)腫瘤細胞數量稀少，與正常細胞的整體差異不是很明顯，且不同部位的腫瘤及不同病人的同部位腫瘤的性質(zhì)也可能有所不同；早期癌癥患者體內的ctDNA難以富集足夠濃度，早期難以檢測發(fā)現；外泌體雖然性能穩定，但目前研究還不充分等問(wèn)題，這都增加了檢測的難度，也是未來(lái)需要解決的問(wèn)題。但是隨著(zhù)檢測手段的不斷進(jìn)步，檢測靈敏度和穩定性的逐步提高，技術(shù)瓶頸終會(huì )被突破，在可期的將來(lái)隨著(zhù)技術(shù)的成熟，液態(tài)活檢各種方法聯(lián)合使用將在腫瘤早期篩查、動(dòng)態(tài)監測、預后判斷以及產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，因為單一的檢測方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足臨床的需要，而越來(lái)越傾向于CTC、ctDNA和外泌體聯(lián)合輔助診斷，只有液態(tài)活檢的“三駕馬車(chē)”攜手并進(jìn)才能更好地推動(dòng)液態(tài)活檢真正走入臨床治療實(shí)踐，成為輔助診斷密不可分的一部分。