【編者按】恒瑞源正的MASCT多靶點(diǎn)自體免疫細胞技術(shù)及源正細胞neoantigens個(gè)體化腫瘤自體免疫細胞技術(shù)均是收集腫瘤患者的外周血中免疫細胞，通過(guò)DC負載抗原（包括neoantigens）特異性激活殺傷性T細胞，體外擴增后回輸。最新一期SteveRosenberg小組發(fā)表在《自然-醫藥》雜志上的文章《Prospectiveidentificationofneoantigen-specificlymphocytesintheperipheralbloodofmelanomapatients》即是從晚期惡性黑色素瘤患者的外周免疫細胞中可根據PD-1受體表達找到針對腫瘤變異新抗原的活性殺傷T細胞。這樣找到的T細胞在體外增殖后和腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）一樣可以識別患者自身腫瘤。以前收集這樣針對腫瘤新抗原的活性T細胞需要腫瘤組織，但提取腫瘤組織比取血要困難很多。所以這個(gè)辦法可能大大簡(jiǎn)化特異殺傷T細胞的生產(chǎn)。

　　淋巴細胞能夠識別非自身的蛋白(抗原)并加以清除。對于腫瘤細胞來(lái)說(shuō)，除了生殖系來(lái)源的突變（從父母遺傳獲得），往往還包含大量的體細胞突變。這些僅存在于腫瘤細胞體細胞突變被稱(chēng)為腫瘤的“新抗原”（Neoantigens）。但事實(shí)上，病人體內的腫瘤往往并不能被免疫細胞有效清除。其部分原因是免疫檢驗點(diǎn)蛋白（PD-L1,CTLA-4等）的表達降低了免疫系統的效率，使少量接觸腫瘤組織的免疫細胞（淋巴浸潤細胞，TIL）不能被有效激活、擴增（腫瘤細胞很”聰明”有沒(méi)有?。?。

　　基于此，一個(gè)簡(jiǎn)單的設想就是把腫瘤特有的Neoantigens作為靶標，通過(guò)分離病人自身可以識別neoantigens的一小部分免疫細胞，體外進(jìn)行激活、擴增，然后再回輸到病人體內，達到清除腫瘤的目的。

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　　Rosenburg團隊通過(guò)研究，證明晚期癌癥患者的腫瘤組織中存在可以對抗腫瘤突變的淋巴細胞的、即便是在晚期膽管癌兇險又難治的瘤種。

　　Rosenberg團隊建立的方法流程：

　　圖示：以ERBBIPneoantigen突變?yōu)槔闹委熈鞒谈庞[。①對病人腫瘤樣本進(jìn)行測序，找到腫瘤特異的26個(gè)非同義突變。②分組串聯(lián)構建這26個(gè)點(diǎn)突變的微小閱讀框（tandemminigene，TMG）來(lái)體外轉錄成mRNA，然后轉染到病人自己的抗原呈遞細胞（DC細胞）使之被表達、加工并呈遞給淋巴細胞。③分離腫瘤浸潤的淋巴細胞（TIL）和轉染抗原呈遞細胞共培養，篩選有反應的TIL和TMG組合，最終鑒定出ERBBIP突變和匹配的CD4+Vb22+T細胞克隆。④體外大量擴增這種TIL，然后回輸到病人體內。（KohS,etal.,2014）。

　　第一步，通過(guò)高通量測序的方法找到某個(gè)病人腫瘤組織特有的體細胞突變。一個(gè)前提就是不同的病人其腫瘤組織包含的突變往往是不同的，因此，需要針對每個(gè)人進(jìn)行外顯子組序列的分析鑒定，找到病人腫瘤特異的neoantigens。

　　第二步，鑒定這些neoantigens中哪些是有效的。分組串聯(lián)體外轉錄，然后轉染到病人自己的抗原呈遞細胞使之表達加工呈遞。

　　第三步，分離病人的TIL，和抗原呈遞細胞共培養，檢測哪些neoantigen和TIL克隆的組合可以識別反應。

　　第四步，體外擴增這種TIL，回輸到病人體內。利用這種方法，幾例黑色素瘤病人的反應非常好，有的病人體內的腫瘤完全被清除。但這里有一個(gè)技術(shù)上的問(wèn)題：從病人腫瘤組織里分離TIL有限制，有時(shí)候根本得不到，這就限制了這一方法的使用。

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　　那么除了浸潤在腫瘤組織中的T細胞，患者的外周血的T細胞是否也存在能夠識別腫瘤的T細胞呢？如果有，我們怎么找到這些T細胞呢？這次發(fā)表在NatureMedicine上的文章，是Rosenburg博士團隊的最新作品，就是解決這個(gè)問(wèn)題的，在本研究中，作者試圖從病人外周血中分離可以識別neoantigens的淋巴細胞（外周血取材不要太方便?。?。

　　黑色素瘤中淋巴浸潤細胞及新抗原特異性的淋巴細胞可以同時(shí)表達多種抑制性以及共刺激性受體，作者之前的工作發(fā)現CD8+TILs上表達的PD-1能夠作為marker鑒定可以識別腫瘤細胞的淋巴T細胞群。所以他們考慮到能否用PD-1作為分子marker，來(lái)識別循環(huán)系統中黑色素瘤患者的neoantigen特異性淋巴細胞。

　　借助高通量個(gè)體化的篩選策略，作者從四位黑色素瘤患者的三人的外周血中成功檢測到了新抗原特異性的淋巴細胞（Fig1）。

　　Fig1.循環(huán)和腫瘤滯留的淋巴細胞中PD-1表達量的比較；以及從循環(huán)的淋巴細胞中分離出對黑色素瘤neoantigen有反應的淋巴細胞。PBMC(peripheralbloodmononuclearcells，外周血單核細胞)中的循環(huán)淋巴細胞也有一部分（雖然很少）可以對腫瘤neoantigen有反應。這類(lèi)淋巴細胞可以用PD-1陽(yáng)性篩選出來(lái)。

　　a)PBMC和腫瘤來(lái)源的CD8+淋巴細胞中PD-1的表達量比較。b)腫瘤來(lái)源和PBMC來(lái)源的CD8+淋巴細胞中PD-1和TIM-3（左）、LAG-3（中）或4-1BB（右）共表達的情況。c)流式分選循環(huán)CD8+淋巴細胞時(shí)比例的選擇。d-i)利用IFN-γELISPOT實(shí)驗(d,f,h)和流式分選4-1BB顯示呈遞病人neoantigen的DC和不同的淋巴細胞組（CD8+,CD8+PD-1hi,CD8+PD-1?和CD8+PD-1+）共培養的情況。

　　雖然檢測到的量比較低，但從這三名患者CD8+PD-1+（非CD8+PD-1?）細胞中成功檢測到分別能夠靶標3,3和1個(gè)特異性的新抗原的淋巴細胞（Fig2-3）。

　　Fig2.從病人NCI-3998分離的循環(huán)CD8+PD1+淋巴細胞可以特異性針對該病人的neoantigen起反應。該圖主要描述一下分選出循環(huán)淋巴細胞的一些特征。比如可以特異性識別TMG1，TMG3和TMG5，并進(jìn)一步鑒定出突變的肽段（分別包含MAGEA6E>K,PDS5AY>F;H>YandMED13P>S）(a)。而且這種識別是特異性的，因為這群富集的淋巴細胞對WT的肽段并沒(méi)有應答（b）。進(jìn)一步，通過(guò)在cos7共轉染突變的微小基因和HLA基因，作者也鑒定了是哪種HLA來(lái)呈遞這些突變的肽段(c)。通過(guò)deepsequencing作者富集了并鑒定CD8+PD1+循環(huán)淋巴細胞TRA和TRB基因中V-J或V-D-J可變區的序列，并把表達量最高的兩種（A1，A2和B1，B2）互相組合通過(guò)逆轉錄病毒引入到PBMC中，這些PBMC能夠識別對應的neoantigen(d,e,f)。

　　Fig3.被病人NCI-3784,NCI-3903andNCI-3713的CD8+PD-1+循環(huán)淋巴細胞靶向識別鑒定的neoantigens。類(lèi)似的，從另外3位病人循環(huán)淋巴細胞分離出來(lái)的CD8+PD-1+淋巴細胞，可以識別多種neoantigens。特別的，NCI-3713這位病人在經(jīng)過(guò)TIL治療之后腫瘤完全消失。但作者從該病人治療之前PBMC中分離出來(lái)CD8+PD-1+循環(huán)淋巴細胞同樣可以識別突變產(chǎn)生的腫瘤neoantigen(e,f)

　　從外周血中分離的neoantigen特異性的T細胞和表達新抗原特異性T細胞受體（TCRs）的淋巴細胞都能夠識別病人自身腫瘤。

　　值得注意的是，對腫瘤細胞識別的特異性和識別neoantigens的TCR庫來(lái)說(shuō)，外周血中來(lái)源和腫瘤組織中浸潤的CD8+PD-1+淋巴細胞是類(lèi)似的（Fig4），這暗示了循環(huán)系統中的CD8+PD-1+淋巴細胞能夠作為一個(gè)展示腫瘤組織內部的抗腫瘤淋巴細胞的窗口。因此，外周血中PD-1作為一個(gè)分子marker可以用來(lái)鑒定分離多種特異性識別腫瘤細胞的淋巴細胞群。

　　Fig4.比較TCR和分離的特異性CD8+淋巴細胞對自身腫瘤的殺傷作用。作者利通過(guò)基因工程改造的方法把可以特異性識別病人NCI-3998三個(gè)nelantigens（MAGEA6E>K-,PDS5AY>F;H>Y-orMED13P>S）的TCR表達在T細胞中，或者利用病人NCI-3784和NCI-3903外周血來(lái)源并可以特異性識別neoantigen的CD8+T細胞分別和來(lái)自對應病人的腫瘤細胞系共培養，發(fā)現兩種方法的淋巴細胞都表現出不錯的腫瘤細胞識別能力（a-c）。在這5個(gè)獨立的試驗中，是循環(huán)CD8+PD-1+,而不是CD8+PD-1?淋巴細胞可以直接識別腫瘤細胞（d）。數據表明，循環(huán)CD8+PD-1+細胞群除了可以識別特異性的neoantigens，還能識別一些腫瘤自身其他抗原（非突變），比如NY-ESO-1，MAGEA3，SSX2，MART1，GP100和TYR（e,f,g）。作者還發(fā)現循環(huán)和腫瘤浸潤的CD8+PD-1+淋巴細胞在識別腫瘤抗原能力上高度類(lèi)似（h）。而且，deepsequencing表明二者TRB基因V-D-J區序列也高度一致（i）。

　　這項研究表明，黑色素瘤患者外周血中確實(shí)存在抗腫瘤活性的T細胞，這為腫瘤治療性的研究提供了一種全新的無(wú)創(chuàng )策略。雖然占比小于5%的血液CD8+T細胞，但這群循環(huán)CD8+PD-1+T細胞確實(shí)可以全部識別4例黑色素瘤病人的腫瘤突變抗原和共有的抗原。

　　這提示，我們可以通過(guò)分離循環(huán)CD8+PD-1+T細胞或者利用neoantigen特異的TCR來(lái)定制個(gè)性化的細胞療法。而且，還可以考慮和PD-1單抗聯(lián)合用藥。通過(guò)對固定的腫瘤病理切片、穿刺取樣或液體活檢得到的腫瘤樣本進(jìn)行全外顯子測序，并結合本文的方法一起為T(mén)細胞為基礎的細胞療法提供了一種相對無(wú)創(chuàng )的系統性治療方法。