抗體藥物電荷異質(zhì)性研究進(jìn)展：堿性組分中分離出影響Fc功能的非巖藻糖化蛋白

　　作為大分子蛋白，由于其表達體系的不確定性導致其結構的多變性，抗體藥物的質(zhì)量控制一直是研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。從一級結構的氨基酸序列，到二級結構的二硫鍵連接，再到高級結構的蛋白質(zhì)構像，任何維度的結構變化都可能對藥物的穩定性和活性產(chǎn)生影響，因此近十幾年來(lái)抗體藥物的結構與功能關(guān)系研究始終處于研究的前沿。

　　基于這些結構與功能研究工作的深入，進(jìn)一步給抗體藥物的質(zhì)量控制提供了指導。在“質(zhì)量源于設計”的指導框架下，平臺化的工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中，基于蛋白質(zhì)本身的物理化學(xué)特性，抗體藥物的多聚體含量、電荷異質(zhì)性、疏水異質(zhì)性和糖基化分布檢測一直是抗體藥物的初步質(zhì)量控制手段。

　　抗體藥物電荷異質(zhì)性結構與功能關(guān)系共識

　　這些抗體蛋白的物理化學(xué)通常會(huì )互為影響，一方面的影響會(huì )引起另一方面的變化。例如，糖基化中唾液酸化蛋白比例的增加通常會(huì )引起電荷異質(zhì)性中酸性蛋白比例的增加。作為共識，早前時(shí)候對于堿性蛋白的研究通常與氨基化、去賴(lài)氨酸化和甲硫氨酸氧化的蛋白雜質(zhì)聯(lián)系在一起。

　　但是前不久，維也納自然資源與生命科學(xué)大學(xué)（University of Natural Resources and LifeSciences, Vienna）、新加坡A_STAR生物研究中心和Apeiron Biologics在一株嵌合性抗GD2抗體（ch14.18）的結構研究中，發(fā)現堿性化蛋白與非巖藻糖化和高甘露化蛋白的含量呈正相關(guān)性，進(jìn)一步影響ADCC等相關(guān)的Fc片段效應功能，這也應該是抗體堿性變體與糖基化異質(zhì)性有關(guān)的首次報道，為下游工藝中糖基化異質(zhì)性的去除和抗體藥物的質(zhì)量控制提供了指導（Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs,2016, VOL. 8, NO. 8, 1548-1560）。

　　堿性電荷異質(zhì)性蛋白的發(fā)現

　　在對不同臨床時(shí)期的抗GD2抗體（ch14.18）進(jìn)行結構比對研究時(shí)，研究者發(fā)現三個(gè)不同時(shí)期生產(chǎn)批次的藥物的電荷異質(zhì)性有明顯差異。“Newton”批次生產(chǎn)于2004年；“Darwin”批次生產(chǎn)于2011年，下游純化工藝小幅改進(jìn)后的試運行批；“Curie”批次生產(chǎn)于2013年，轉移到新的外包服務(wù)商的GMP運行批。IEF和IEX的分析結果均表明，最早的生產(chǎn)批次“Newton”主峰含量明顯低于后面生產(chǎn)的兩個(gè)批次（“Darwin”和“Curie”），而酸性峰和堿性峰含量則明顯高于后兩批。

　　三個(gè)批次的IEF分析結果

　　三個(gè)批次的制型IEX分析結果

　　隨后研究者通過(guò)制備型色譜對各個(gè)批次下的蛋白進(jìn)行區段收集，對最早期的“Newton”批次的堿性峰收集了多達25區段，進(jìn)一步做了結構與功能的分析。

　　堿性電荷異質(zhì)性蛋白的分析

　　隨后研究者使用SPR分別對這些分離的區段與GD2、FcγRⅢa和 FcRn結合力進(jìn)行了分析，以反映這些區段蛋白的活性、ADCC活性和半衰期。

　　GD2 binding的SPR分析結果

　　GD2 binding的SPR分析結果表明，相對主峰蛋白，隨著(zhù)蛋白的酸性和堿性程度越高，GD2 binding的Kd越大，意味著(zhù)與GD2的結合能力越弱。從幾個(gè)批次來(lái)看，“Newton”批次與GD2的結合能力最低，“Darwin”批次的優(yōu)之，“Curie”批次的最高，其活性也最高。

　　FcγRⅢa binding的SPR分析結果

　　ADCC活性檢測分析結果

　　CDC活性檢測分析結果

　　糖基化分布檢測分析結果

　　FcγRⅢa binding的SPR分析結果表明，相對酸性蛋白，主峰和堿性蛋白FcγRⅢa結合能力更強，意味著(zhù)其ADCC能力更高。特別值得注意的是，“Newton”批次中的B2含量顯著(zhù)低于其它批次。因此從幾個(gè)批次來(lái)看，“Newton”批次與FcγRⅢa的結合能力最高，即ADCC活性最高；“Darwin”批次的次之；“Curie”批次的最低。

　　堿性區段中到底是哪些特定蛋白影響了藥物的ADCC呢？研究者很自然地想到了進(jìn)一步對這些分離區段進(jìn)行糖基化分布的分析，結果表明，在堿性組分中的高甘露糖化和非鹽藻糖化蛋白比例明顯高于酸性峰和主峰，這顯然與大家對高甘露糖化和非鹽藻糖化蛋白的功能認識相符的。

　　為了進(jìn)一步驗證堿性組分中是否還有其它的蛋白變體，研究者發(fā)現堿性組分1(B1)和堿性組分2(B2)中的甲硫氨酸氧化、N端焦谷氨酸化和C端去賴(lài)氨酸化程度基本一致，排除了由其它途徑帶來(lái)的結構變化，說(shuō)明這些堿性蛋白主要是由高甘露糖化和非鹽藻糖化的蛋白引起的。

　　FcRn binding的SPR分析結果

　　FcRn binding的SPR分析結果表明，主峰、堿性組分1(B1)和堿性組分2(B2)與FcRn 的結合能力是最強的，更高程度的酸性蛋白和堿性蛋白都會(huì )減少與FcRn 的結合能力。

　　CH2和CH3的Nano DSC分析結果

　　通過(guò)Nano DSC進(jìn)一步對分離組分進(jìn)行熱穩定性分析，發(fā)現各批次不同組分的CH2和CH3轉化溫度基本一致，說(shuō)明組分之間的熱穩定性沒(méi)有差異。但是“Newton”批次各組分的CH2和CH3均高于其他批次，說(shuō)明該批次下的藥物穩定性與其他兩個(gè)有明顯差異，這可能是由于“Newton”不同的制劑配方引起的。

　　堿性電荷異質(zhì)性蛋白的產(chǎn)生原因

　　按照“質(zhì)量源于設計”的思路，通常在發(fā)現質(zhì)量差異后，繼而鑒定結構與功能的關(guān)系，再進(jìn)一步回到工藝中分析質(zhì)量差異的產(chǎn)生原因，以利于后期質(zhì)量的穩定控制。但本研究中研究者并沒(méi)有回到工藝中尋找質(zhì)量差異的源頭?？赡苁钦麄€(gè)項目開(kāi)發(fā)時(shí)間太長(cháng)，蛋白結構的變化很難確定是否是由于工藝變化引起還是儲存穩定性引起的。研究者推測這些批次的電荷異質(zhì)性有可能是由于制劑配方和存儲溫度的差異引起的，也有可能是基于“Darwin”和“Curie”改良的下游工藝引起的。

　　小編小結

　　從這一研究的研究思路看，很難說(shuō)明是一項特別完整的研究，甚至部分數據令人十分費解。但是研究者們仍然用相對完整的研究，首次從堿性電荷異質(zhì)性蛋白中分離出高甘露糖化和非鹽藻糖化的蛋白，為其它藥物的結構研究和質(zhì)量控制提供了借鑒。

　　同時(shí)，本文也是首次利用WCX-10分析柱在制備規模分離這些電荷區段，為后期在下游階段設計分離工藝提供了借鑒。不同電荷組分的抗體蛋白等電點(diǎn)差異極小，基本在0.1~0.2 pH單位，傳統的純化工藝很難將它們去除，創(chuàng )新型填料的開(kāi)發(fā)有可能實(shí)現這一目標。另一方面，抗體的糖基化基本為中性糖，目前下游基本沒(méi)有相關(guān)方法去除相關(guān)雜質(zhì)，很大程度由上游細胞株和培養工藝決定，優(yōu)化途徑極為有限。如果本文研究結果具備普遍性，是否意味下游特定工藝也可以分離相關(guān)糖基化變體，這對工藝開(kāi)發(fā)研究人員和結構研究者是個(gè)好消息。

　　最后，需要說(shuō)明的是，對于抗體藥物的電荷異質(zhì)性研究仍然需要具體問(wèn)題具體分析。不同藥物的電荷變化原因也不盡相同，同時(shí)這些電荷結構的變化是否會(huì )引起藥物功能的變化也是疑問(wèn)。值得注意的是，去年FDA批準的兩個(gè)抗體類(lèi)似藥CTP-13和ABP501，都與原研藥的電荷分布有較大差異，進(jìn)一步說(shuō)明抗體藥物的電荷異質(zhì)性控制是個(gè)難點(diǎn)，相關(guān)研究也應依具體項目而有所差異。