貝利木單抗誕生記

　　貝利木單抗2011年獲得FDA批準，用于治療系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，簡(jiǎn)稱(chēng)SLE），成為56年來(lái)首個(gè)用于SLE的新藥。作為基因組學(xué)研究催生的少數新靶點(diǎn)藥物之一，貝利木單抗的研發(fā)過(guò)程同樣具有重要的借鑒意義，本文將介紹貝利木單抗誕生的故事。

　　正如前文所述（系統性紅斑狼瘡研究史），系統性紅斑狼瘡是一種極為復雜的自身免疫病疾病，患者體內B細胞過(guò)度活化，產(chǎn)生大量自身抗體，抗原抗體復合物被補體識別，啟動(dòng)補體途徑，攻擊自身組織，導致多器官、組織的損傷。

　　HGS：基因組學(xué)發(fā)現SLE潛在治療靶點(diǎn)BLyS

　　B細胞活化因子是一種天然蛋白，1999年5月由美國國立猶太醫學(xué)中心和科羅拉多大學(xué)的研究人員合作發(fā)現，并命名為T(mén)ALL-1。1999年6月，另一篇文獻中將該蛋白命名為BAFF，1999年7月，Human Genome Sciences（簡(jiǎn)稱(chēng)HGS）公司的研究人員在文獻中將該蛋白稱(chēng)為BLyS（B lymphocyte stimulator）。

　　HGS是一家專(zhuān)注mRNA研究的生物技術(shù)公司，他們發(fā)現BLyS在PBMC和淋巴結、脾臟等淋巴組織中高表達，并發(fā)現BLyS是一種B細胞刺激因子。HGS經(jīng)過(guò)分析，認為BLyS可以作為自身免疫病如RA、SLE的潛在治療靶點(diǎn)。

　　2000年10月，HGS與劍橋抗體技術(shù)公司（Cambridge Antibody Technique，簡(jiǎn)稱(chēng)CAT）簽訂合作協(xié)議，共同開(kāi)發(fā)靶向BLyS的抗體。根據協(xié)議，CAT負責抗體的篩選，HGS選擇合適的候選抗體進(jìn)行臨床研究。

　　CAT：篩選1287種抗體

　　2003年，CAT發(fā)表了一篇文獻，CAT通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選了超過(guò)1000種抗體，其中超過(guò)半數可以阻止BLyS與受體結合。

　　CAT篩選此次篩選BLyS抗體的抗體庫來(lái)自80個(gè)人的可變區重排，容量為1010~1011。CAT提供進(jìn)行了4種方法、2-5輪篩選，第一輪“淘洗”后，有幾千個(gè)被篩選出來(lái)。從第二輪開(kāi)始，采用噬菌體ELISA進(jìn)行篩選，BLyS被包被到板子上，然后篩選可以結合BLyS的抗體（噬菌體上的scFv）。CAT共篩選了7000多個(gè)（81塊96孔板）克隆，其中有2875（39%）個(gè)可以結合BLyS。

　　這2875個(gè)抗體的DNA序列都被確定，去除重疊（相同序列的克?。┖?，確認有1287個(gè)抗體，涵蓋了1098個(gè)VH序列和705個(gè)VL序列。

　　篩選出來(lái)的抗體panel多樣性可通過(guò)與VH、VL、D、J數據庫序列比對，發(fā)現42/49個(gè)VH、24/27個(gè)D、6/6個(gè)JH域出現在panel中，輕鏈可變區多樣性不如重鏈但仍極為可觀(guān)：19/33個(gè)Vλ、13/35個(gè)Vк、3/7個(gè)Jλ、4/5個(gè)Jк出現在Panel中。

　　通過(guò)噬菌體ELISA確認了1287個(gè)可以結合BLyS的抗體，CAT隨后用生化方法來(lái)檢測這些抗體能否拮抗BLyS與其B細胞受體的結合（細胞學(xué)實(shí)驗）。結果發(fā)現有500個(gè)抗體可以拮抗BLyS與受體的結合：100個(gè)抗體可以拮抗80%的結合、200個(gè)抗體可以拮抗60%-80%的結合、200個(gè)抗體可以拮抗40%-60%的結合。

　　CAT從拮抗BLyS與受體結合80%以上的抗體中選取了33個(gè)進(jìn)行純化，得到純品并測定與BLyS結合的IC50值，結果在9nM-420nM之間。

　　CAT選取了5個(gè)抗體，把scFv形式轉為IgG形式，其中有3個(gè)（AB-3、AB-7、AB-12）的效價(jià)有所提高，另外兩個(gè)AB-1、AB-2的效價(jià)則略有下降。

　　CAT的前期篩選非常充分，為確認候選抗體做好了準備工作。

　　HGS：確認候選抗體

　　2003年晚些時(shí)候，HGS發(fā)表了一篇文獻，從CAT篩選的抗體庫中，確認了一種候選抗體lymphoStat-B，也就是后來(lái)的貝利木單抗。

　　HGS首先選取了6個(gè)親和力高的scFv，將其轉為IgG形式，顯示hBLySmAb-1、hBLySmAb-2有最強的抑制效果。由此確定了2個(gè)候選scFv，接下來(lái)HGS對這2個(gè)scFv進(jìn)行親和力成熟改造：對這2個(gè)scFv的VH CDR3末端6個(gè)氨基酸進(jìn)行隨機突變，篩選出對應的親和力更強的scFv。

　　HGS由此確定了2個(gè)候選scFv：hBLySsc-1.and hBLySsc-2,，接下來(lái)HGS對這2個(gè)scFv進(jìn)行親和力成熟改造：對這2個(gè)scFv的VH CDR3末端6個(gè)氨基酸進(jìn)行隨機突變，篩選出對應的親和力更強的scFv，即hBLySsc-1.1（IC50為0.7nM，比hBLySsc-1高10倍）和 hBLySsc-2.1（IC50為0.2nM，比hBLySsc-1高20倍）。

　　HGS將親和力改造的scFv庫中選取親和力最高的30幾個(gè)scFv都轉為IgG形式，再次測定親和力。hBLySsc-1.1轉為IgG后的hBLySmAb-1.1具有最強的活性，成為候選藥物，命名為L(cháng)ymphoStat-B（即貝利木單抗）。

　　HGS對LymphoStat-B進(jìn)行了一系列體內體外試驗，發(fā)現LymphoStat-B對BLyS有高親和力，如能導致食蟹猴脾臟和淋巴結的B細胞衰竭。證實(shí)LymphoStat-B具有治療自身免疫病的潛力。之后HGS便加緊推進(jìn)LymphoStat-B的RA、SLE適應癥的臨床研究，其中RA適應癥在II期失敗，SLE則繼續前行。

　　歷經(jīng)曲折終上市

　　2006年8月，HGS與葛蘭素史克簽訂合作協(xié)議，葛蘭素史克協(xié)助HGS完成貝利木單抗的三期臨床研究，兩家企業(yè)平均分擔后期研發(fā)費用，平分商業(yè)利潤。

　　2011年3月9日，FDA正式批準貝利木單抗用于治療SLE，商品名為Benlysta。2012年8月，葛蘭素史克完成對HGS的收購，Benlysta成為葛蘭素史克旗下產(chǎn)品。

　　值得一提的是，貝利木單抗的臨床策略起到了至關(guān)重要的作用，因為貝利木單抗只有輕微的療效。而SLE作為一種復雜的自身免疫疾病，臨床上通常采用多藥聯(lián)合治療，如激素等，這會(huì )干擾SLE新藥的療效評估，也成為SLE新藥的最大瓶頸。貝利木單抗在二期臨床中同樣未表現顯著(zhù)的療效，HGS在分析數據時(shí)沒(méi)有用常規的臨床癥狀重點(diǎn)，而是組合式的臨床終點(diǎn)。這時(shí)候，HGS和葛蘭素史克已經(jīng)意識到激素藥物會(huì )嚴重干擾貝利木單抗的療效評估，在隨后的三期臨床中，兩家公司嚴格限制只有服用低劑量潑尼松的患者入組，最大程度避免其他藥物的干擾。調整策略后，貝利木單抗的三期臨床獲得正面評價(jià)，雖然只有輕微療效，仍然成功獲得FDA批準。

　　2016年，Benlysta銷(xiāo)售額為3.06億歐元。