腫瘤免疫治療的耐藥機制

　　前言

　　自從2014年anti-PD-1單抗Opdivo和Keytruda被批準上市以來(lái)，腫瘤免疫治療的熱浪席卷全球，取得了空前的成功。除Opdivo和Keytruda外，還有anti-CTLA-4單抗Yervoy以及anti-PD-L1單抗Tecentriq獲FDA批準上市。這些免疫檢查點(diǎn)抑制劑在黑色素瘤，非小細胞肺癌，腎細胞癌，霍奇金淋巴瘤，膀胱癌等多種癌癥中表現出了令人欣喜的療效，其中Keytruda還在2016年獲批一線(xiàn)治療PD-L1高表達(>50%)的非小細胞肺癌。然而免疫檢查點(diǎn)抑制劑并不是萬(wàn)能的“神藥”，也存在其缺陷，其中一項就是由于耐藥性而導致的響應率不高與腫瘤復發(fā)再進(jìn)展。腫瘤免疫耐藥可分為原發(fā)性耐藥(primary resistance)，適應性免疫耐藥(adaptive immune resistance)以及獲得性耐藥(acquired resistance)。在anti-PD-1療法治療黑色素瘤中，約有60%的患者不響應(primary resistance)，還有一部分患者在初始響應后腫瘤出現了再進(jìn)展。本文就詳細介紹下腫瘤免疫耐藥的機制。

　　黑色素瘤患者對anti-PD-1療法的臨床響應

　　導致原發(fā)性/繼發(fā)性耐藥的腫瘤內在原因

　　這些原因主要是腫瘤細胞上特定基因或通路的表達或上調，從而導致腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤以及功能受到抑制。具體如下:

　　導致免疫療法耐藥的腫瘤內在原因

　　MAPK通路的激活與或PTEN表達的缺失而引起的PI3K通路的增強。癌基因信號通過(guò)MAPK通路導致VEGF與IL-8的產(chǎn)生，從而抑制T細胞的招募與功能。此外，在多種腫瘤中，腫瘤抑制基因PTEN表達缺失從而PI3K通路增強，這與IFNγ，顆粒酶B的基因表達量降低以及腫瘤浸潤CD8+ T細胞的數目減少是高度相關(guān)的。

　　WNT/β-catenin信號通路的持續表達。癌基因信號通過(guò)穩定β-catenin導致WNT信號通路持續激活，從而將T細胞排除在腫瘤之外。在人Non-T-cell-inflamed的黑色素瘤中，腫瘤內在的β-catenin信號基因高度表達，且在腫瘤微環(huán)境中缺少T細胞與CD103+ DC細胞。

　　腫瘤上PD-L1的高表達。腫瘤上高表達的某些配體如PD-L1，會(huì )抑制抗腫瘤T細胞的應答。多種機制可能導致PD-L1高表達，包括PTEN的缺失或PI3K/AKT的突變，EGFR突變，MYC過(guò)表達，CDK5基因破壞以及PD-L1基因3’-UTR的截短。目前還不知道PD-L1的高表達是否會(huì )對anti-PD-1/PD-L1的響應有影響，但是它會(huì )影響其他的腫瘤免疫療法。

　　IFNγ信號通路的缺失。由腫瘤特異的T細胞產(chǎn)生的IFNγ，能夠識別腫瘤細胞或抗原遞呈細胞上的相應受體，從而發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫響應。IFNγ能夠增強MHC分子的表達，從而增強腫瘤抗原提呈作用。IFNγ也能夠招募其他的免疫細胞，或者直接抑制腫瘤細胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。因此腫瘤細胞上IFNγ通路相關(guān)蛋白，如IFNγ受體IFNGR1與IFNGR2，IFNγ受體鏈JAK1與JAK2，STATs，IRF1等突變與缺失，都會(huì )導致對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的耐藥。

　　缺少腫瘤抗原，從而導致T細胞無(wú)法激活。免疫療法依賴(lài)于腫瘤抗原特異的T細胞。在人黑色素瘤，腎細胞癌，非小細胞肺癌中，DNA突變頻率高，腫瘤免疫原性更強，因而對anti-PD-1療法響應更好。而在胰腺癌以及前列腺癌中，DNA突變頻率低，腫瘤免疫原性低，對anti-PD-1療法響應差。

　　抗原提呈機制存在缺陷。在某些情況下，由于抗原加工過(guò)程中的蛋白酶體成員，轉運蛋白，MHC本身以及beta-2-微球蛋白(B2M)的功能缺陷，會(huì )導致抗原提呈機制不能有效地將腫瘤抗原提呈到細胞表面。B2M在HLAI家族的折疊與轉運到細胞膜的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，若其喪失功能，則CD8+T細胞失去了識別功能。

　　存在一系列特定基因的表達。在對PD-1療法沒(méi)有響應的腫瘤中，有一些基因表達被富集，被稱(chēng)為innate anti-PD-1 resistance signature，或IPRES。這些基因與間葉細胞的轉化，全能型以及傷口愈合相關(guān)，且更傾向于表達在胰腺癌等對PD-1不響應的腫瘤中。

　　導致原發(fā)性/繼發(fā)性耐藥的腫瘤外部原因

　　這些原因是由于腫瘤微環(huán)境中一些成員發(fā)揮抗癌免疫響應的抑制作用，主要包括調節T細胞Tregs，髓樣抑制細胞MDSCs，M2巨噬細胞，其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)與抑制性細胞因子等。

　　導致免疫療法耐藥的腫瘤外部原因

　　Tregs。Tregs能通過(guò)分泌抑制性細胞因子或者通過(guò)直接的細胞接觸來(lái)抑制效應T細胞Teffs的響應。許多人腫瘤中發(fā)現了浸潤的Tregs，且鼠模型中去除腫瘤微環(huán)境中的Tregs能夠顯著(zhù)提高免疫響應。由于CTLA-4在Tregs上高表達，anti-CTLA-4能夠顯著(zhù)提高Teffs/Tregs的比例，從而提高腫瘤對免疫療法的響應。

　　Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)。MDSCs在多種病理條件包括腫瘤，發(fā)揮著(zhù)免疫響應調節因子的作用。人MDSCs表達CD11b+與CD33+，但是不表達HLA-DR以及系種特異的抗原CD3，CD19與CD57。MDSCs能夠促進(jìn)血管生長(cháng)，腫瘤侵襲與轉移。腫瘤微環(huán)境中MDSCs的存在與降低的生存率以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法的響應率相關(guān)。目前實(shí)驗中使用PI3Kγ抑制劑來(lái)調節巨噬細胞功能，在老鼠模型中，PI3Kγ抑制劑與anti-PD-1聯(lián)用表現出了良好的腫瘤抑制效果。

　　M2 macrophages。腫瘤相關(guān)的巨噬細胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)也能夠影響免疫治療的響應。TAMs包括M1巨噬細胞和M2巨噬細胞，在大多數情況下M2巨噬細胞占TAMs的大多數。其中M1巨噬細胞能夠高表達IL-12，IL-23，MHC以及B7家族分子來(lái)促進(jìn)抗原提呈與Th1細胞的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用；而M2巨噬細胞能夠分泌抑制性細胞因子IL-10與TGF-β，從而抑制免疫響應與促進(jìn)腫瘤生長(cháng)與轉移。臨床上TAMs的數目越多，腫瘤預后就越差。臨床前實(shí)驗使用巨噬細胞集落刺激生長(cháng)因子受體1(CSF-1R)的抑制劑，能夠顯著(zhù)減少TAMs數目，抑制腫瘤生長(cháng)。CSF-1R抑制劑與anti-CTLA4或anti-PD1再加上吉西他濱聯(lián)用，能夠有效緩解單獨anti-CTLA-4或anti-PD1不響應的鼠胰腺癌模型。

　　其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)。除了PD-1與CLTA-4，T細胞上還存在其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)，包括TIM-3，LAG-3，BTLA，TIGIT，和VISTA等。具體可見(jiàn)小編之前的文章《免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗體藥總結》。

　　免疫抑制細胞因子與免疫抑制分子。腫瘤或者巨噬細胞會(huì )釋放一些免疫抑制細胞因子或者免疫抑制分子來(lái)減弱局部的抗腫瘤免疫反應。TGF-β能夠促進(jìn)血管生成，刺激Tregs從而發(fā)揮免疫抑制作用。在多種腫瘤中，高水平的TGF-β都伴隨著(zhù)極差的預后。臨床前實(shí)驗使用TGF-β受體激酶抑制劑與anti-CTLA-4聯(lián)用，或者放療與TGF-β抑制劑都顯示出了較好的腫瘤抑制效果。在細胞外，CD39能夠將ATP水解成AMP，進(jìn)一步被胞外核苷酶CD73加工為免疫抑制分子腺苷adenosine。Adenosine能夠通過(guò)T細胞上的A2A受體抑制T細胞的增殖與細胞毒活性，也能通過(guò)腫瘤細胞上的A2B受體促進(jìn)腫瘤轉移。多種類(lèi)型的腫瘤中，CD73的高表達伴隨著(zhù)較差的預后，且會(huì )影響anti-PD-1的效果。此外，IFNγ會(huì )促進(jìn)免疫抑制分子IDO的表達，IDO能直接負調控效應T細胞的功能。

　　趨化因子與趨化因子受體。某些特異的趨化因子與趨化因子受體在MDSCs和Tregs往腫瘤微環(huán)境的運輸過(guò)程中起到重要作用。腫瘤細胞能夠分泌配體CCL5，CCL7和CXCL8，通過(guò)結合MDSCs上表達的CCR1及CXCR2受體，從而將MDSCs吸引至腫瘤微環(huán)境中。CCR4在Tregs上高表達，anti-CCR4能夠有效抑制T細胞的招募并通過(guò)ADCC效應減少Tregs的數目。此外CXCR4是CXCL12的受體，CXCL12能夠通過(guò)影響Tregs定位等多種方式發(fā)揮免疫抑制作用。

　　腫瘤浸潤細胞上CD28的表達。CD28是T細胞的共刺激分子，對于T細胞的激活，增殖和存活起到關(guān)鍵作用。在人出生時(shí)，所有T細胞都會(huì )表達CD28，但是CD28的表達量會(huì )隨著(zhù)年齡的增加而下降，80歲時(shí)會(huì )有10-15%的CD4+ T細胞以及50-60%的CD8+ T細胞缺失CD28表達。CD28-T細胞產(chǎn)生的主要原因是重復的抗原刺激。CD28表達的消失只存在與人和靈長(cháng)動(dòng)物中，在鼠中并沒(méi)有被發(fā)現。在今年3月9日的《Science》上，發(fā)表了來(lái)自Emory疫苗中心的研究工作，他們發(fā)現CD28對于耗盡的CD8+T細胞(Exhausted CD8+ T Cell)的再激活是必須的。在老鼠模型中，阻斷CD28-B7共刺激通路，會(huì )影響腫瘤特異CD8+T細胞的增殖和激活，降低對anti-PD-1/PD-L1療法的響應。在經(jīng)過(guò)anti-PD-1治療的NSCLC病人中，增殖的CD8+T細胞(高Ki-67表達)大都為PD-1陽(yáng)性，且被激活(高HLA-DR，CD38表達)。和鼠模型中一樣，這些增殖的CD8+T細胞大都是CD28陽(yáng)性的，說(shuō)明了CD28共刺激對于腫瘤浸潤的PD-1+CD8+T細胞的增殖與再激活是至關(guān)重要的。因此，CD28可以用作預測anti-PD-1療法響應程度的分子標記。

　　獲得性耐藥的產(chǎn)生原因

　　腫瘤免疫療法的一個(gè)顯著(zhù)特點(diǎn)是腫瘤響應的時(shí)間長(cháng)，但是在使用anti-CTLA-4或anti-PD-1治療黑色素瘤的患者中，大約有1/4-1/3的患者在經(jīng)歷初始響應后出現了腫瘤進(jìn)展，即獲得性耐藥。獲得性耐藥的產(chǎn)生可能是因為在治療過(guò)程中出現了上文所述的那些原因，包括T細胞功能的喪失，腫瘤抗原提呈出現缺陷以及其他一些新突變的產(chǎn)生。例如，在一類(lèi)較晚獲得anti-PD-1耐藥性的病人中，發(fā)現了B2M的突變，從而導致抗原提呈機制缺陷。在另兩例獲得性耐藥腫瘤中，發(fā)現了IFNγ通路中JAK1或JAK2發(fā)生了突變。

　　在2016年《nature communication》上，有研究者發(fā)現anti-PD-1耐藥性的產(chǎn)生與抑制性免疫檢查點(diǎn)TIM-3的的表達量升高密切相關(guān)。在兩個(gè)老鼠腫瘤模型中，耐藥后與給藥前相比，腫瘤浸潤的T細胞而非外周血或脾臟T細胞上的TIM-3表達量顯著(zhù)上調，且TIM-3表達量上調的主要是那些結合了anti-PD-1抗體的T細胞。需注意的是TIM-3表達量升高是anti-PD-1療法特異的，因為anti-CTLA-4中并未檢測到類(lèi)似現象。此外，腫瘤細胞上TIM-3配體Galectin-9的表達量也顯著(zhù)升高。當anti-PD-1療法出現耐藥后，聯(lián)用anti-TIM-3，顯著(zhù)提高了生存率。有意思的是，當anti-PD-1和anti-TIM-3聯(lián)用被耐藥，腫瘤重新進(jìn)展時(shí)，那些結合了anti-PD-1和anti-TIM-3抗體的T細胞上，其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)如CTLA-4，LAG-3的表達量明顯升高。這說(shuō)明了腫瘤浸潤T細胞的抑制性免疫調節是動(dòng)態(tài)變化的，存在著(zhù)補償效應。最后，在兩例對anti-PD-1療法獲得性耐藥的NSCLC病人腫瘤樣本中，也觀(guān)察到了TIM-3而非其他抑制性免疫檢查點(diǎn)的表達量顯著(zhù)升高。這些結果說(shuō)明了anti-PD-1和anti-TIM-3聯(lián)用是對于那些anti-PD-1療法獲得性耐藥病人的一個(gè)良好策略。

　　Anti-TIM-3與anti-PD-1聯(lián)用能顯著(zhù)抑制腫瘤進(jìn)展

　　應對腫瘤免疫耐藥的方案

　　隨著(zhù)精準醫療的概念深入人心，鑒定出有效的生物標記來(lái)預測免疫療法的響應與耐藥非常有意義。這些生物標記包括基因組標記，免疫調節基因表達量以及浸潤CD8+T細胞的密度和分布等免疫標記。相對于之前使用的治療前本底水平的生物活檢(pre-treatment baseline biopsies)，縱向的多次活檢(longitudinal biopsies)可能會(huì )更好地預測腫瘤對治療的響應。最近研究表明相比于治療前的標記，治療早期樣本的免疫標記有更好地預測效果。

　　此外，應對腫瘤免疫耐藥的一個(gè)有效方法就是聯(lián)合用藥。Anti-PD-1與anti-CTLA-4聯(lián)合用藥治療轉移性黑色素瘤顯示出了更高的響應率。Anti-PD1與anti-TIM-3/anti-LAG-3/anti-TIGIT的聯(lián)合用藥在臨床前實(shí)驗都展示出了極佳的效果，臨床試驗也正在進(jìn)行中。除了免疫檢查點(diǎn)抑制劑之間聯(lián)用，免疫檢查點(diǎn)抑制劑與共刺激因子激動(dòng)劑，靶向藥，放療化療以及表觀(guān)遺傳修飾因子的聯(lián)用都在探索之中。希望未來(lái)免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠聯(lián)合一些便宜的非專(zhuān)利藥，來(lái)減少聯(lián)合用藥帶來(lái)的高花費。

　　腫瘤免疫治療的聯(lián)用方案

　　結語(yǔ)

　　腫瘤免疫治療改變了腫瘤治療的格局，但是其耐藥性限制了它的療效與應用。希望在接下來(lái)的幾年里能開(kāi)發(fā)出合適的生物標記來(lái)指導個(gè)性化用藥，從而提高免疫治療的響應。此外，通過(guò)聯(lián)合用藥，減少原發(fā)性耐藥帶來(lái)的副作用，提高免疫治療的響應率，爭取在一些anti-PD-1單一療法不起作用的癌癥類(lèi)型，如胰腺癌和前列腺癌上取得成功。